脑源性神经营养因子Val66Met基因多态性与首发精神分裂症认知功能的关联研究*

崔开艳 孙萌萌 刘兰芬，2 杨丽敏 王 妍 乔冬冬 王汝展 王丽娜

精神分裂症患者的认知功能缺陷，是精神分裂症核心症状之一［1］，被认为是精神分裂症的内表型中很重要的组成部分，与精神分裂症的其他临床症状相比更稳定，更具有可遗传性，可能更接近精神分裂症的生物学本质［2］，因而对精神分裂症认知功能的研究可能更有助于寻找和定位精神分裂症的易感基因。在精神分裂症的病因学中，神经发育障碍假说近年备受重视。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养因子家族中最重要的成员之一，对中枢神经系统功能的产生和维持发挥着重要作用。BDNF Val66Met基因的单核苷酸多态性即编码多肽链上第66位缬氨酸(Val)的密码子GUG被编码蛋氨酸(Met)的密码子AUG取代，从而引起中枢功能性BDNF的低表达。有研究显示，BDNF Val66Met基因多态性可能在人类认知功能的损害中起到重要作用［3～5］，并且可能与认知功能相关的脑结构，如海马、前额叶皮层［6，7］形态改变相关。然而既往研究的结果不一，并且其研究对象多为欧美人群，针对中国汉族人群的研究较少，我们选取中国汉族首发精神分裂症患者和正常对照者作为研究对象，以探索中国汉族人群BDNF Val66Met基因多态性在精神分裂症病因及病理机制中的作用及其与首发患者认知功能的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 精神分裂症患者组(患者组):90例首发精神分裂症患者，男46例，女性44例，年龄16～54岁，平均(26.16±8.90)岁。入组标准:符合美国精神疾病诊断与统计手册第4版(DSM-Ⅳ)精神分裂症的诊断标准;首次发作;年龄16～60岁的汉族住院患者;入组前4周内未使用抗精神病药物，入组前6个月未接受过无抽搐电休克治疗(MECT)。排除标准:合并严重躯体疾病者;符合DSM-Ⅳ诊断标准的其他精神疾病者。正常对照组(对照组):100名健康体检者，男性59例，女性41例，年龄17～53岁，平均(25.4±5.8)岁。对照组入组标准:年龄16～60岁的中国汉族人群，既往无精神疾患史。排除标准:有严重躯体疾病者，妊娠或哺乳期妇女，家族史阳性者。两组年龄及性别比例的差异均无统计学意义(P＞0.05)。该研究通过山东省精神卫生中心伦理委员会的批准同意。所有入组人员均来自山东省汉族人群，均知情同意，精神分裂症患者由本人及其监护人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 量表工具 (1)DSM-Ⅳ:用于精神分裂症患者的诊断，由两名工作5年以上的主治或主任医师明确诊断。(2)精神分裂认知功能成套测验共识版(MCCB):由美国国立精神卫生研究院于2003年启动的MATRCS计划制定，2009年由北京回龙观医院邹义壮等人将其翻译成中文，其中文版信效度研究显示与英文版在国外的测试结果基本一致，可作为评价精神分裂症患者认知缺陷的标准化测量工具［8］。该测验共包括10项分测验，结构上形成7个心理维度:①处理速度:连线测验、符号编码测验、语义流畅性测验 ②注意/警觉:持续操作测验;③工作记忆:数字序列测验、空间广度测验;④语言学习和记忆:言语记忆测验;⑤视觉学习和记忆:视觉学习记忆测验;⑥推理与问题解决能力:迷宫测验;⑦社会认知:情绪管理测验。(3)威斯康星卡片分类测验(WCST)评估精神分裂症患者的执行运动功能。

1.2.2 基因组DNA提取 抽取所有受试者晨7时空腹肘静脉血5 ml，3 000转/分离心10 min，分离血清和白细胞，保存于-70℃待测;采用改良碘化钾法提取DNA，保存于-70℃待测。

1.2.3 基因型鉴定 TaqMan法检测SNP。PCR反应体系为 10 μl，包括 TaqMan PCR Master Mix 5 μl，2 ×引物 0.375 μl，2 × 探针 0.5 μl，2.25 μl双蒸水，1 μl目标 DNA。正向引物 5＇-AAC ATC CGA GGA CAA

GGT GG-3＇;反向引物:5＇-GGA CAT GTT TGC AGC ATC TAG GTA A-3＇;供体杂交探针 5＇-GCT CTT CTA TCA CGT GTT CGA AAG TG-FL-3;受体杂交探针5＇-LC640-CAG CCA ATG ATG TCA AGC CTC TTG AAC CTG-PH-3＇。TaqMan法中所用到的两条探针分别带着不同的荧光报告基团FAM和HEX。通过收集、分析不同的荧光信号强度，分析SNP等位基因。如果样本只有FAM或HEX荧光增强，其SNP分型为纯合子;如果FAM和VIC同时增强，则为杂合子。对于荧光信号增强不明显的样本重复检测。随机挑选40例DNA样本进行复孔检测，结果一致率为 99.99%，说明TaqMan法进行SNPs基因型鉴定结果可靠。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计数据处理。连续型数值变量使用均数±标准差进行统计描述;采用拟合优度卡方检验对不同基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验;采用卡方检验比较患者组与对照组基因型频率和等位基因频率是否不同;采用方差分析比较不同基因型精神分裂症患者认知功能得分是否不同;采用LSD法进行两两多重比较。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡法则吻合度检验 两组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，说明研究样本为随机样本，具有群体代表性。

2.2 两组基因型频率及等位基因频率分布比较 两组基因型频率和等位基因分布频率差异均有统计学意义(P=0.027，P=0.007);患者组 Met等位基因的频率要高于对照组(P=0.007)。见表1。

表1 两组BDNF Val66Met基因多态性基因型、等位基因频率比较

2.3 不同BDNF基因型间精神分裂症患者MCCB得分的比较 MCCB的10项测验中只有连线错误数和空间广度得分在3组不同基因型患者间的得分差异具有统计学意义(P＜0.05)，进一步两两比较后发现Met/Met基因型患者的连线错误数大于Val/Val和Val/Met基因型者(P ＜0.05，P ＜0.01)，Val/Val基因型患者和Val/Met基因型的患者在连线错误数上差异无统计学意义(P＞0.05);在空间广度得分上发现Val/Val基因型者得分高于Val/Met和Met/Met基因型者 (P ＜0.05，P ＜0.01)，Val/Met和 Met/Met两组间无统计学差异(P＞0.05)，见表2。

2.4 不同BDNF基因型间精神分裂症患者WCST得分的比较 WCST测验中发现3种不同基因型患者正确应答数得分差异具有统计学意义(P＜0.05)，进一步两两比较发现Val/Val纯合者的正确应答数高于Val/Met基因型者(P＜0.01)，而 Val/Val基因型者与Met/Met者及Val/Met者与Met/Met者间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表2 患者组认知功能MCCB得分在BDNF基因型间的比较(x±s)

表3 患者组认知功能MCCB得分在BDNF基因型间的比较(x±s)

3 讨论

精神分裂症神经发育障碍假说认为在大脑的发育过程中，基因控制的异常分子水平可引起神经元分化、迁移及突触形态的改变，并导致个体今后对精神分裂症的易感［9］。Egan 等［10］的研究显示 BDNF Val66Met基因变异虽然不会影响成熟的BDNF功能，但是会对BDNF前体蛋白造成影响，这会导致中枢BDNF功能下降。Chen等［11］研究也显示，BDNFMet变异不仅影响变异BDNF蛋白向神经树突细胞的分布及分泌，而且当正常BDNF蛋白与变异BDNF蛋白作用于同一神经细胞时，变异的BDNF还可以影响正常BDNF蛋白的运输。而BDNF在中枢神经系统高表达并且对其功能的产生和维持发挥着十分重要的作用，尤其是在海马部位［12］。大量研究表明BDNF对与精神分裂症发病机制密切相关的神经元如海马神经元［13］、黑质多巴胺能神经元［14，15］、谷氨酸能神经元［16］及 5-羟色胺能神经元［17］起着营养支持作用，被认为可能与精神分裂症的发病相关。本研究发现首发精神分裂症BDNF Val66Met基因型频率及等位基因分布频率与正常对照者之间存在统计学差异，且Met/Met基因型及Met等位基因在精神分裂症患者中的频率均高于正常对照者，提示Met基因携带可能是精神分裂症的危险因素，这一研究结果和国外相关研究是一致的［18，19］。然而，国内外也有研究认为BDNF Val66Met基因多态性与精神分裂症无相关［20～22］。既往研究结果不同的原因可能是:(1)由于所选研究对象的不同，因其地域或种族的不同，其基因分布频率可能不同，也有研究证实BDNF Val66Met基因型频率和等位基因频率在不同人群中存在差异［23］。(2)可能是由于精神分裂症存在遗传异质性，且目前精神分裂症不是一个疾病单元，而是一组临床综合征，存在临床异质性有关。

精神分裂症具有症状重叠，诊断一致性很低的临床异质性。虽然采用国际通用的分类系统和诊断标准，如DSM和ICD分类系统，但是目前所有的分类体系都是建立在临床症状评定的基础之上的，精神分裂症不是一个疾病单元，而是一组临床综合征。临床异质性已经成为困扰精神疾病病因学研究的一大障碍。许多学者认为精神分裂症患者的神经认知功能较其临床症状更能反映疾病的本质，可作为精神分裂症病因学研究中“内表型”之一。

既往有研究显示:抗精神病药物的使用可能对精神分裂症患者的认知功能造成影响［24］，故我们选取未经治疗的首发精神分裂症患者作为研究对象，以排除抗精神病药物的影响。本研究应用MCCB对精神分裂症患者的认知功能进行评估，比较分析不同基因型精神分裂症患者的MCCB得分:在MCCB测验中，反映患者处理速度的连线错误数和反映患者工作记忆功能的空间广度得分及WCST卡片分类测验中的正确应答数在3种不同基因型的患者间具有统计学差异;进一步两两比较后发现Met纯合患者的连线错误数多于携带Val等位基因的患者;在空间广度得分上，发现携带Met等位基因的患者要差于Val纯合的患者;本研究结果提示:携带Met等位基因的精神分裂症患者的处理速度、工作记忆可能更差，BDNF Met变异可能与首发精神分裂症患者的处理速度及工作记忆认损害有关。本研究结果与既往欧美国家的研究基本是一致的。国外Ho等［25］的研究显示:Met等位基因携带者的精神分裂症患者认知损害更重，与其相对应的大脑颞叶和枕叶灰质体积更小，该研究提示BDNF Met基因变异可能在精神分裂症患者认知损害中有具有特定作，且BDNF基因变异、大脑结构损害及认知损害的关联。Egan等［3］人的研究显示，不论是在精神分裂症患者还是在正常对照人群，携带Met等位基因者的学习记忆等认知功能及海马结构均较 Val纯合子差。Hariri等［4］的研究发现在正常人群中Met携带者空间广度得分较Val纯合子差，认为BDNF Val66Met多态性可能对正常人的认知功能有影响作用。然而Foltynie等［26］人的研究呈现相反的结果，他们认为Met携带能够改善认知功能。

WCST卡片分类测验是目前广泛使用的一种检测额叶执行功能的测验，反应患者的高级认知功能，受试者评分低提示其额叶受损，有执行功能障碍。本研究发现3组不同基因型精神分裂症患者在正确应答数一项上存在统计学差异，且Val/Met基因型的精神分裂症患者其正确应答数要低于Val/Val纯合的患者。提示BDNF Met变异可能与精神分裂症患者的执行障碍有关。精神分裂症患者的脑影响学研究间接支持了本研究结果。Ho等［27］测量了119例精神分裂症患者脑结构的改变，结果显示Met基因携带者额叶体积减少比Val纯合子患者更明显，同时其侧脑室的增大也更明显，提示BDNF Met基因变异可能是导致精神分裂症患者额叶体积变化的原因之一。而额叶可能与人类高级认知功能密切相关。然而，Rybakowski等［28］的研究认为BDNF Met基因变异可能与精神分裂症患者的认知缺陷无关，而与双向障碍患者的认知功能缺陷相关。既往研究结果存在差异的原因可能有:(1)BDNF Val66Met多态性只是与精神分裂症患者的部分认知缺陷相关，而不是与所有的认知缺陷相关。(2)各研究所选择的研究对象所存在的临床异质性及遗传异质性，所选用的认知功能的检测工具不同所造成的偏倚。(3)BDNF Val66Met基因多态性的作用可能受其他基因位点的干扰，有研究表明REST基因多态性影响BDNF Val66Met对认知功能的作用［29］。

总之，到目前为止，从流行病学到分子遗传学研究，无可争辩的证明遗传因素是精神分裂症最为重要的病因之一。本文的病例对照研究提供了进一步的证据支持BDNF Val66Met基因是精神分裂症的易感基因，并发现BDNF Val66Met基因多态性与精神分裂症认知缺陷内表型之间的阳性关联。本研究结果提示内表型策略的运用和分子生物学技术的发展，有望在不久的将来在该领域取得突破。

本研究的局限性在于仅对BDNF Val66Met一个遗传位点进行了研究，而精神分裂症是多基因遗传疾病;本研究的样本量较小，故需在多基因遗传位点、大样本量的深入进一步研究。

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