单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株的构建

李胜军，阎雪晶，王舰

（中国医科大学1.基础医学院免疫学教研室；2.第95期临床医学七年制；3.基础医学院病原生物学教研室，沈阳110001）

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）广泛存在于自然界中，是一种人畜共患病的病原菌，能通过污染的食品引起人、畜的李氏特菌病，易感者为新生儿、孕妇、40岁以上的成人和免疫功能缺陷者，感染后主要表现为食物中毒、败血症、脑膜炎和单核细胞增多［1～3］。在LM感染过程中，LM对宿主细胞的黏附发挥关键性作用，这种黏附与LM的一些表面蛋白有关，如InlA、InlB、VIP、SrtA、纤维黏连蛋白结合蛋白（FbpA）等［4］。FbpA有570个氨基酸，与肺炎链球菌表面的黏附分子PavA、化脓性链球菌表面的黏附分子Fbp54具有高度的同源性，在LM黏附宿主细胞过程中发挥重要作用［5］。本研究通过PCR从LM基因组中扩增出fbpa基因全序列及其上、下游基因序列，并构建可用于其基因敲除的质粒，将基因敲除质粒导入LM后，通过同源重组的方法构建LM的fbpa基因敲除菌株（Δfbpa）以便进一步研究其致病机制及fbpa基因功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及培养基：LM1b1684标准株、大肠杆菌DH5α菌株、质粒pCRⅡ、pAULA（中国医科大学免疫学教研室），胰酶大豆肉汤（Tryptic Soy broth，TSB）、溶菌肉汤（Luria-Bertani，LB）培养基（美国BD Biosceneces公司）。

1.1.2 实验试剂：限制性内切酶BamHⅠ、KpnⅠ、SalⅠ 、 碱 性 磷 酸 酶 、DNA Marker DL1000、DNA Marker DL2000（日本TaKaRa公司），T4 DNA ligase（美国Promega公司），基因组DNA小量抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒（碧云天生物技术研究所），细菌PCR试剂盒（美国GENERON公司），Plasmid mini kitⅠ（美国 Omega公司），Western blot试剂盒（蓝基生物科技）。

1.1.3 实验仪器：PTC-200型PCR扩增仪（美国MJ RESEARCH公司），MUPID电泳仪（美国Advance公司），GDS-8000型全自动凝胶成像分析仪（美国UVP公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 LM、Δfbpa和大肠杆菌DH5α菌株的培养：LM、Δfbpa以TSB培养基，大肠杆菌以LB培养基，37℃、120 r/min培养。

1.2.2 LM基因组DNA的制备：收集过夜培养的LM，按基因组DNA小量抽提试剂盒说明书抽提基因组DNA，置于-20℃冰箱冻存备用。

1.2.3 fbpa（IMO1829）及其上下游基因（IMO1828、IMO1830）片段的克隆及扩增：取10 ng基因组DNA为模板，采用正向、反向引物（表1）进行全序列扩增，反应条件：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72℃55 s，72℃4 min，30个循环，72℃10 min。PCR 产物经2%琼脂糖电泳后，按DNA凝胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段。回收片段与载体质粒pCRⅡ相连，分别常规转化大肠杆菌DH5α，平板培养并筛选出阳性克隆，LB培养基37℃恒温振荡过夜培养，收集菌体，按Plasmid mini kitⅠ试剂盒说明书提取质粒。获得的质粒分别命名为pCRⅡ-fbpa、pCRⅡ-IMO1828、pCRⅡ-IMO1830。分别以 KpnⅠ、BamHⅠ、SalⅠ限制性内切酶双酶切3种质粒，经2%琼脂糖电泳后，回收目的基因片段，置于-20℃冰箱冻存备用［6］。

1.2.4 敲除质粒的构建：采用KpnⅠ、BamHⅠ双酶切，将pAULA载体质粒线性化，采用碱性磷酸酶进行线性化载体质粒尾端去磷酸化，防止自连，经1.25%琼脂糖电泳后，胶回收、纯化载体。取前一操作制备的上游基因片段（534 kb）与线性化的pAULA载体在14℃连接过夜。连接物常规转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆采用KpnⅠ、BamHⅠ限制性内切酶双酶切鉴定。获得的质粒命名为pAULA-upstream。按照如上操作，以BamHⅠ、SalⅠ双酶切pAULA-upstream，连接下游基因片段（575 kb）与线性化的pAULA-upstream，常规转化大肠杆菌DH5α，获得的质粒命名为 pAULA-Δfbpa［5］。

1.2.5 基因敲除菌株的构建：将pAULA-Δfbpa质粒与LM放入2 mm电转杯，在2.5 kV、5 ms条件下将pAULA-Δfbpa质粒转入LM后实现同源重组，LBEm培养筛选出温度敏感突变株［7］。

1.2.6 蛋白质提取与Western blot鉴定：LM、Δfbpa经TSB培养基37℃振荡过夜培养，收集菌体，超声裂解细菌，15000 r/min、4℃离心15 min，取上清5 μL进行定量，蛋白定量后取30 μg总蛋白经10%SDS-PAGE凝胶分离，4℃过夜，恒压转移至PVDF膜上，按Western blot试剂盒说明书进行FbpA鉴定。

2 结果

2.1 fbpa（IMO1829）基因及其上下游基因片段的克隆及鉴定结果

将PCR扩增的fbpa及其上下游基因（IMO1828、IMO1830）与pCRⅡ连接后，分别常规转化大肠杆菌DH5α，扩增后抽提质粒，双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测，显示fbpa、IMO1828、IMO1830基因片段成功克隆（图1）。

2.2 敲除质粒构建及鉴定结果

构建的敲除质粒pAULA-Δfbpa采用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定得1109 bp和未切完全的原质粒（约9 kb）2个条带的克隆为阳性克隆（图2）。

2.3 敲除菌株鉴定结果

抽提LM、Δfbpa的基因组DNA，采用fbpa基因正向、反向引物，PCR扩增，PCR产物电泳结果显示Δfbpa基因组DNA无fbpa基因片段（图3）。LM、Δfbpa过夜培养后，收集并超声裂解细菌，提取蛋白并定量后，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot检测，结果显示Δfbpa无FbpA蛋白表达（图4）。

2.4 敲除菌株生长特性鉴定结果

LM、Δfbpa过夜培养，以5%的接种量转接到新鲜的100 mL TSB培养基中，37℃、120 r/min培养，分别在0、1、2、4、6、12、24 h 检测菌体的生长情况，敲除菌株与标准菌株生长趋势基本一致（图5）。

3 讨论

LM是广泛存在于自然界中经由食物传染的革兰阳性菌，可以引起人和动物的各种感染症，感染后主要表现为食物中毒、败血症、脑膜炎和单核细胞增多［1～3］。LM可侵袭宿主专职及非专职吞噬细胞，侵袭过程包括侵入宿主细胞、裂解吞噬溶酶体或内溶酶体、在细胞质内增殖、细胞与细胞之间的传播等［8～11］。

LM对宿主细胞的黏附发挥关键性作用，这种黏附与LM的一些表面蛋白有关，如InlA、InlB、VIP、SrtA、FbpA 等［4］。FbpA 有570个氨基酸，与肺炎链球菌表面的黏附分子PavA、化脓性链球菌表面的黏附分子Fbp54具有高度的同源性，在LM黏附宿主细胞过程中发挥重要作用［5］。

在研究细菌表面黏附分子FbpA在LM感染症发病机制中的作用时，有必要表达并提纯重组FbpA蛋白及构建fbpa基因敲除菌株。本文作者已表达并提纯重组FbpA蛋白。在本研究中，我们通过PCR从LM基因组中扩增出fbpa基因全序列及其上、下游基因序列，并构建可用于其基因敲除的质粒，将基因敲除质粒导入LM后，通过同源重组的方法构建LM的fbpa基因敲除菌株（Δfbpa）。本研究成果有利于进一步研究FbpA蛋白在LM侵袭宿主细胞过程中，对LM黏附宿主细胞、LM从吞噬溶酶体或内溶酶体逃脱、LM在细胞质内的增殖、LM在细胞与细胞之间的传播的影响。

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