奶牛性控精液与常规精液抗氧化物酶活性比较分析

赵宪林，昝林森，田万强，胡建宏，王韦华

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100;2.渭南职业技术学院 农学院，陕西 渭南 71400;3.杨凌职业技术学院 动物工程系，陕西 杨凌 712100)

奶牛性别控制技术是目前家畜繁殖新技术之一，应用流式细胞仪进行X、Y精子分离已经进入商业化生产阶段[1]。与常规精液相比，性控精液在精子质量及受精率方面还有不足之处[2-3]。在精液的冷冻-解冻过程中，精液的稀释和体外处理等程序都会对精子造成一定的损伤，造成大量精子死亡并产生活性氧簇离子(ROS)，从而导致精浆中抗氧化酶类的活力降低，影响精液品质。Aitken等[4]研究认为，ROS对精子的活力有极大的损害作用。ROS存在于精浆中，主要来源于芳香族氨基酸所催化死亡精子发生的反应[5]。Flaherty等[6]在对人类的精液研究认为，ROS不但能降低精子的活力，而且能引起男性不育。在精液中含有多种抗氧化物酶，其主要功能是消除精液中过多的ROS，过多的ROS则可导致精子质膜过氧化和DNA损伤，少量的ROS对于精子的获能和顶体反应是必须的[7]，因此精液精浆中的抗氧化物酶的活力大小与精子品质和精子受精率有着密切的关系。虽然如此，关于性控精液品质及常规精液抗氧化酶活性方面的研究对于奶牛性别控制非常重要，但性控精液精浆抗氧化酶类的变化研究还未见报道。

本研究旨在探讨荷斯坦公牛性控精液和常规精液在活力、顶体完整率及精浆中四种抗氧化物酶类(ROS,GR,CAT,GSH)的活力差异，为性控精液的生产提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与试剂

主要仪器：流式细胞分离仪(MOFO-SX)、程控冷冻仪(法国卡苏公司)、三相差荧光显微镜(NIKON公司)、离心机5810R (Eppendorf AG)、恒温热循环水浴锅(sotemp 3028H)、电热恒温培养箱(HH-B11·500型)，电热鼓风干燥箱(HG101-2型)，电子分析天平(BS124S AG型)，细管一体机(法国，DIGITCOOL-5300型)，比色密度测定仪(RS-232型)。

主要试剂：果糖(天津石科密欧化学试剂开发中心)，柠檬酸钠(天津市福晨化学试剂厂)，甘油(天津市化学试剂三厂)，庆大霉素(山西晋新双鹤药业有限责任公司)，林肯霉素(山西晋新双鹤药业有限责任公司)，壮观霉素(sigma)。

1.2 精液稀释液的制备

100 mL稀释液：2.9 %柠檬酸钠37 mL，12 %蔗糖液36.2 mL，卵黄20 mL，甘油6 mL。

上述稀释液用磁力搅拌器搅拌30 min 以上，4 ℃冰箱内过夜备用。在精液稀释前加入庆大霉素1.3 mL，林肯霉素0.3 mL，壮观霉素35 mg，磁力搅拌器搅拌10 min，再放入37.5 ℃水浴锅中备用。

1.3 精液采集及分离

本次试验地点是黑龙江大庆市大庆田丰生物技术有限公司。本试验选择年龄3～5岁，体质健壮、繁殖性能良好的荷斯坦种公牛，采用假阴道法采精。精液采集后立即送至检测室进行活力鉴定，活力大于0.65、密度大于1.5×109mL-1、且无异常气味及颜色正常的精液视为合格精液。鉴定合格精液送染色室进行活体染色。染色后的精液样品送至分离室，使用细胞流式仪进行X、Y精子分离。

1.4 精液冷冻

分离后的精液先在4 ℃环境中平衡90 min，再在添加VC的稀释液中平衡10 min，离心，加稀释液至目标浓度，然后用分装机分装，分装好的精液放入4 ℃冰箱中平衡4 h。平衡后的稀释精液，用分装机吸入有标识的塑料细管内并封口,然后把细管均匀摆放在细管金属架上，然后将摆放细管的金属架放入程控冷冻仪中进行程控降温，当温度降到-140 ℃时，细管投入液氮保存。

1.5 精液的解冻

从液氮中迅速取出3支冻精细管，立即投入38.5 ℃的温水中解冻30 s，用于相关指标分析。

1.6 精子质量及精浆中抗氧化物酶活力检测

1.6.1 精子活力检测 本次试验精子活力由肉眼观察进行测定[8]。

1.6.2 精子顶体完整率检测 细管冻精解冻后，取细管中间的一滴精液于载玻片的左端，用另一张边缘光滑的载玻片呈35°角自左端接触液滴，拉向另一侧，制成抹片。自然风干5～10 min后，用福尔马林磷酸盐固定液固定15 min，水洗干燥后，用姬姆萨染色90 min，自来水冲洗，干燥，显微镜下观察300个精子，统计顶体完整的精子数。

1.6.3 精浆酶活力测定 采用南京建成生物技术公司生产的酶活力测定试剂盒，按照试剂盒说明的操作规程测定精浆超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)四种酶活力。

1.7 统计分析

所有数据均用平均数±标准差表示，采用SPSS 13.0软件进行t检验。

2 结果与分析

2.1 常规精液与性控精液活力和顶体完整率比较

冻融后精子活力及顶体完整率的高低与精子受精率直接相关[8]。由表1可以看出，性控精液的精子活力比常规精液低5.33 %，与常规精液精子活率比较差异显著(P<0.05)。性控精液的顶体完整率高出常规精液10.96 %，达到差异极显著水平(P<0.01)。

表1 常规精液和性控精液活力和顶体完整率比较Table 1 Comparison of vitality and cone complete rate between normal semen and sexed semen

注:同行肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

Note:Different small letters in the same row mean significant difference between treatments(P<0.05)，the capital letter means extreme significant difference between treatments(P<0.01)．The same below.

2.2 常规精液与性控精液抗氧化物酶活力比较

冻融后的常规精液和性控精液精浆中抗氧化酶类的活力见表2。由表2可以看出，性控精液CAT值为0.73 U/mL，低于常规精液3.23 U/mL，与常规精液相比差异极显著(P<0.01)。测定常规精液SOD值为1.27 U/mL，比性控精液高出0.70 U/mL，达到显著差异(P<0.05)。常规精液GSH活力为117.51 U/mL，比性控精液高出41.73 U/mL，差异极显著(P<0.01)。GR活力常规精液为75.59 U/mL，比性控精液高出61.26 U/mL，差异极显著(P<0.01)。

3 讨 论

本试验结果表明，冻融后常规精液在活率方面显著高于性控精液，但在顶体完整率方面性控精液显著高于常规精液。在精浆中的抗氧化物酶类活力方面，性控精液冻融后其精浆中四种抗氧化物酶的活力都显著低于常规精液。

表2 常规精液与性控精液精浆抗氧化物酶活力比较Table 2 Comparison of seminal plasma antioxidant enzyme activity between traditional semen and sexed semen

3.1 性控精液对精子活率和顶体完整率的影响

性控精液虽然可以控制家畜性别，为生产者带来更大的经济效益，但是其受精率低一直是困扰其大面积推广应用的主要因素。性控精液冻后活率低是其受精率低的主要原因。造成性控精液活率低的原因可能是精子经过复杂的程序处理，在进入冷冻程序之前处理时间太长，精子能量消耗较大，活力减弱。分离后活力弱的精子可能会在冷冻解冻过程中大量死亡，有效精子数减少，活率降低。顶体完整率和精子的受精率相关，顶体受损，导致顶体酶流失，使精子失去受精能力。但是本试验表明，性控精液中的顶体完整率高于常规精液，原因可能是在分离的时候，大量的死精子被分离掉，使得原精中顶体破损并死亡的精子被除去。

3.2 性控精液对精浆中抗氧化物酶活性的影响

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物酶[12]，能还原对精子有毒害作用的过氧化物成为无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护精子细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。本次试验证明性控精液的精浆中谷胱甘肽过氧化物酶极显著常低于规精液差异，由此可以证明在性控精液的冷冻及解冻过程中，精液中存在较大量的ROS。在精浆中GR也能消除H2O2，GR在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，使H2O2还原成H2O。所以在冷冻精液中GR的活力的高低与精子的品质也有很重要的关系。本试验表明在性控精液中GR值显著低于常规精液，则表明性控精液中极的精浆酶GR的活力低于常规精液。

综上所述，在性控精液的精浆中四种抗氧化物酶类活力都显著低于常规精液四种酶活力，活力低的原因可能是冷冻前对精液处理时间过长，导致精浆酶的值下降。也有可能是在精子活体染色的过程中，染料对GR的活力造成抑制，或者是精液稀释液中缺乏对精浆酶起有效保护的物质。由此可以表明，性控精液中的四种抗氧化酶类的活力值的高低与性控精液的品质有很大关系，可能是造成受精率低的重要原因。研究开发性控精液高效稀释液和冷冻保护剂，提高性控精液精子活力，保证精液抗氧化物酶活力是当务之急。

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