福建省羊口疮的流行病学调查与PCR诊断

董晓宁，李文杨，刘 远，高承芳，张晓佩，林碧芬

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013)

羊口疮是由羊口疮病毒(orf virus，OrfV)引起羊和人接触性、嗜上皮性传染病，通过直接或间接接触传染[1]。据报道该病发病率可达50%，造成了养羊业巨大经济损失[2]。由于OrfV与某些病原感染后的临床症状非常相似，尤其存在继发或混合感染时，更增加了临床诊断难度。目前准确诊断OrfV的方法有电镜检查、病毒分离、血清学诊断、PCR等，前两种方法费时且需昂贵的设备，血清学诊断往往存在交叉反应，PCR由于具有特异性好、敏感性高、检测快捷方便等优点，常用于该疾病的诊断[3]。

随着福建省山羊饲养量的增加，亦有多处山羊或人感染羊口疮病例的临床报道，影响了福建省山羊业的健康发展[4-5]。由于福建省内羊口疮均为临床诊断结果，且缺乏系统流行病学特征及病原调查，一方面导致了免疫防控的困难，另一方面，临床诊断依赖临床病症的出现，准确性、时效性较差，增长了疾病防控的周期。本研究拟开展福建省全省范围内的羊口疮的流行病学调查，并利用PCR方法进行疾病诊断，以期为福建省羊口疮的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 临床流行病学调查及病样采集

于2011年选取泉州、福州、宁德、三明、莆田等地市规模山羊饲养场16个开展羊口疮临床流行病学调查。在感染羊口疮的养殖场内观察感染羊只的病变过程，并采集病料保存备用。

1.2 病料处理

剪下病变痂皮或齿龈根部糜烂组织50～100 mg，用TE浸洗后，研磨，收集匀浆1 mL，反复冻融3次后，8 000 r/min离心10 min，收集上清，-70 ℃保存备用，同一场内病样混合后进行PCR检测。

1.3 病毒DNA提取

病毒DNA提取试剂盒均购自北京鼎国生物技术有限公司，根据说明书提取病毒基因组DNA。提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.4 引物设计

参考颜新敏等[3]报道设计引物，其中上游引物为：5-CGAACTTCCACCTCAACCACTCC-3；下游引物为：5-CCTTGACGATGTCGCCCTTCT-3。扩增羊口疮病毒长为507 bp的特异性片段。引物由上海生工有限公司合成。

1.5 PCR反应体系、反应条件及产物检测

PCR 扩增试剂均构自上海生工有限公司。PCR 扩增的反应体系为：体系总体积 25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL(含Mg2+)，10 mmol/LdNTP Mix 0.4 μL，上下游引物(12.5 μmol/L)各0.3 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA 模板(25 ng/μL)1 μL，灭菌去离子水20.3 μL。扩增条件：94 ℃变性4 min，35个循环扩增(94 ℃：50 s，56 ℃：40 s，72 ℃：30 s)，72 ℃延伸10 min，25 ℃ 1 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2 结 果

2.1 羊口疮的流行概况

各调查点的观察与统计结果表明,该病在福建省内的发病率为10%～20%，死亡率小于10%，多发生于3～6月龄羔羊，呈地方性流行，成年羊发病较少，多为散发。多发生于春、秋季节，无性别和品种差异。病毒生存能力强，在有该病存在的羊群，可多年连续发生。

2.2 羊口疮病毒的PCR检测结果

试验共检测样品21份，其中病样13份，健康羊只样品8份，用PCR扩增病样可得到预期的507 bp条带，健康羊只则不出现任何条带，与实际情况完全符合，见图1。

图1 临床病料PCR扩增结果Fig. 1 The PCR result of different samples M.DL 2000标准Marker；1,2,4,5.不同场病羊扩增结果；3.健康羊只扩增结果

3 讨 论

羊口疮的特点是传播快，发病率高，虽然致死率低，但严重影响感染羊只采食，显著降低养羊生产效率的同时容易造成并发感染加重养殖损失。经过对福建省各养羊场羊口疮的临床流行病学调查，表明羊口疮在福建省的发病率为10%～20%，死亡率小于10%，低于其他养羊集中地区[2,6]，可能饲养品种、模式、规模的区别是导致这一差异的主要原因。

近年来，福建省各地羊口疮病例的报道较多，但均为临床诊断结果，缺乏对病原的认识。由于羊口疮在发病初期的临床症状与山羊痘存在一定的相似性，在血清学上又存在一定的交叉反应，一般的临床诊断方法很难区分；另外，临床诊断依赖临床症状的出现，容易延误最佳疾病控制时期[7]。PCR快速诊断方法能在较短的时间(4～5 h)内完成整个检测过程，且具有特异性强、敏感度高等特点，该方法的建立一方面从分子水平上确诊了福建省羊口疮疾病的病原，另一方面为该地区羊群有效的防治羊口疮疾病提供科学依据。

参考文献：

[1] 殷 震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：977-980.

[2] Mazur C, Machado R D. Detection of contagious pustular dermatitis virus of goat in a severe out break[J]. Vet Rec, 1989, 125:419-420.

[3] 颜新敏，张 强，吴国华，等.双重PCR快速鉴别羊痘病毒和羊口疮病毒[J]. 中国人兽共患病学报，2008,24(10)：945-948.

[4] 陈龙星，李奕梓，陈新梓. 山羊传染性脓疱病的诊治[J]. 福建农业科技，2007(2)：38-39.

[5] 张家确，吴景央. 一起人畜共患羊传染性脓疱病的调查[J]. 中国兽医杂志，2006,42(9)：53-54.

[6] 何水林，陈 杰，蔡玉书，等. 羊口疮病毒的分离与鉴定[J]. 中国兽医科技，2002,3(9)：21-23.

[7] 向智龙，程振涛，卓建华，等. 羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用[J]. 贵州农业科学，2010,38(7)：145-147.