免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色方法检测IgA肾病患者尿足细胞的效果比较

姜文玲，彭佑铭，刘 虹，夏运成，刘伏友

(中南大学湘雅第二医院肾脏病研究所肾病实验室，湖南 长沙 410011)

免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色方法检测IgA肾病患者尿足细胞的效果比较

姜文玲，彭佑铭，刘 虹，夏运成，刘伏友

(中南大学湘雅第二医院肾脏病研究所肾病实验室，湖南 长沙 410011)

目的: 比较免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色2种方法检测IgA肾病(IgAN)患者尿足细胞的效果，为尿足细胞检测方法的选择提供依据。方法：收集43 例确诊为IgAN患者(实验组)和10例正常对照研究对象(对照组)活检前连续3 d的晨尿各200 mL，离心上清制成涂片。IgAN患者按Lee分级分成LeeⅠ～LeeⅤ组。采用抗人足细胞表面标记蛋白Podocalyxin(PCX)单克隆抗体对尿沉渣涂片分别行免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色，荧光显微镜和普通光学显微镜下计数2组研究对象尿足细胞数；采用Spearman相关分析法分析2种方法检测IgAN患者尿足细胞数的相关性。结果：2种方法检测的对照组研究对象尿中未见足细胞，2种方法检测实验组研究对象尿中均可见足细胞；免疫荧光细胞化学法检测足细胞阳性率和检出中位数低于免疫酶细胞化学法，2种方法检测尿足细胞阳性率和中位数比较差异均有统计学意义(Plt;0.05)；2种方法检查患者尿足细胞数呈明显的正相关关系(r=0.842，Plt;0.01)。结论：采用免疫酶细胞化学法检测同一份尿标本的效果优于免疫荧光细胞化学法。

免疫酶细胞化学； 免疫荧光细胞化学； 足细胞； 尿液

IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)是最常见的原发性肾小球疾病,15%～ 40% 的成人患者在10 年后会进展至终末期肾病(end stage renal disease,ESRD),若随访时间超过25 年,该比例可达30%～ 50%[1]。足细胞即肾小球脏层上皮细胞，是肾小球中最易受到损伤的细胞成分[2]，是组成肾小球滤过膜的主要成分和阻止大分子滤过的最后屏障，其在维持毛细血管攀的结构稳定、调节肾小球的滤过功能和肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)的代谢平衡中发挥重要作用[3]。随着近年来对足细胞生物学研究的深入,尤其是在发现足细胞中表达的一些特异性蛋白分子之后,足细胞已被认为是各种原发或继发性肾小球疾病进展的关键细胞[4]。足细胞表面标记蛋白Podocalyxin (PCX) 是足细胞表面覆盖的一层唾液酸糖蛋白，位于足细胞膜上，由于PCX在许多肾小球疾病中不依赖于裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)的完整性而保存完好，因此也是识别尿足细胞最常用的标记蛋白[5]，PCX带有大量负电荷，是防止足突间粘连，维持裂孔膜结构和肾小球滤过膜电荷屏障最主要的物质基础。已有研究[6]发现：表达其他几种标志蛋白的足细胞几乎都表达PCX，即使是凋亡的足细胞仍然表达PCX。因此，临床上将尿PCX 作为检测各种肾小球疾病患者尿足细胞的标志分子，Yamaguchi等[7]认为：应用抗PCX单克隆抗体对尿沉渣进行免疫荧光染色，是一种检测尿中足细胞的特异性方法。为了更准确地反映尿足细胞脱落的情况，本课题组连续收集患者活检前3 d晨尿标本，采用免疫荧光细胞化学染色和免疫酶细胞化学染色法2种不同方法，计数 IgAN不同分级研究对象中的尿足细胞数(未治疗)，并对2种方法的检出阳性率及其相关性进行对比分析，为尿足细胞研究方法的选择提供依据。

1资料与方法

1.1 研究对象 选择2008年9月—2009年2月在本院肾内科住院的43例经肾活检确诊为IgAN患者作为实验组，诊断标准参考文献[8]，继发性IgAN患者均被剔除，Lee’s分级采用1982年Lee等[9]关于IgAN组织学分级方法，将IgA患者分为LeeⅠ～LeeⅤ组。活检前3 d收集实验组患者的尿标本，活检肾组织进行石蜡包埋。其中男性14例，女性29例，年龄14～64岁，平均年龄(31.9±12.5)岁。另外选择本院肾病内科在职工作人员10例，均无高血压、糖尿病、心和肾疾病史，当年常规体检均正常者作为对照组，收集对照组研究对象的尿标本。所有受试者均知情同意。

1.2 尿标本的收集 分3 d收集患者活检前晨尿各200 mL，各取100 mL于低速离心机1 500 r·min-1离心5 min，弃去上清液，留存1 mL沉渣尿，混匀，取20 μL沉渣尿于光学显微镜下用牛鲍氏计算板记数单个核细胞数。单个核细胞阳性标本继续离心涂片。

1.3 尿沉渣涂片和计数 所有玻片均经多聚赖氨酸处理。用微量加样器吸取并混匀后，吸取尿沉渣溶液300 μL于TXD3细胞离心涂片机上，1 500 r·min-1离心5 min，涂片，每个患者每天制成4张涂片，其中2张用于免疫荧光细胞化学染色，另2张则用于免疫酶细胞化学法染色。连续测3 d,共制成12张涂片，取6张涂片计数足细胞数的平均值记为该患者的尿足细胞数。

1.4 免疫荧光细胞化学染色 将上述待染标本的涂片以PBS清洗3次后,置于质量分数为1%的Triton X-100中5 min,以质量分数为1% 的牛血清白蛋白(BSA)封闭,室温15 min,小鼠抗人PCX单克隆抗体(美国Ramp;D公司)1∶10稀释,4 ℃过夜,FITC荧光标记兔抗小鼠IgG(丹麦DAKO公司)体积比为1∶20稀释,4 ℃孵育4 h,甘油封片,荧光显微镜(日本OLYMPUSBX251) 的绿色荧光波长为520 nm。尿液细胞形态完整,PCX染色胞浆阳性。每次实验均设PBS代替一抗的阴性对照组。

1.5 免疫酶细胞化学染色 涂片采用3%H2O2封闭20 min，10%脱脂奶粉封闭，室温20 min，滴加第一抗体(鼠抗人PCX抗体，1∶10稀释)，4℃孵育过夜；免疫组织化学Elivision TM-plus试剂盒(鼠/兔)购自福州迈新生物技术开发公司。显微镜下DAB显色，苏木素复染细胞核。除脱脂奶粉不需用PBS洗涤，所有步骤均需PBS洗涤。

1.6 足细胞计数方法 低倍镜下观察全片，高倍镜下确认足细胞并摄像，计算机储存，然后在全片左、右、上、下和中间5个不同视野，记数20个高倍视野所见足细胞数。

1.7 统计学分析 采用SPSS 11.5 统计软件进行数据分析。足细胞数以M(P25，P75)表示，同一个患者尿标本2种方法所测足细胞数比较采用配对t检验；2种方法检测的足细胞数的相关性分析采用Spearman 相关分析。

2 结 果

2.1 2种方法测得的尿足细胞数 2种方法在对照组研究对象尿中均未测得足细胞。2种方法在实验组研究对象尿中均可见足细胞且免疫酶细胞化学染色法检测的尿足细胞阳性率(81%)和尿足细胞中位数值[8(0.00，31.00)]均高于免疫荧光细胞化学染色法检测的尿足细胞阳性率(62%)和尿足细胞中位数值[2(0.00，20.00)]，差异均有统计学意义(Plt;0.05)。见表1。

表1 免疫酶细胞化学染色法和免疫荧光细胞化学染色法检测对照组和实验组研究对象的尿足细胞数

Tab.1 Number of urinary podocytes of objects in control group and experiment group by immunoenzymatic celluar chemistry and immunofluorescence celluar chemistry method

*Plt;0.05vscontrol group;△Plt;0.05vsimmunofluorescence celluar chemistry method.

2.2 2种方法检测不同分级IgAN患者尿足细胞数 LeeⅠ～LeeⅤ各分级研究对象的尿足细胞中位数值分别如下：LeeⅠ组,0(0.00，4.00)， 0(0.50，4.00)；LeeⅡ组,1(0.00，3.00)， 3(0.00，8.00)；LeeⅢ组,3(0.00，15.00)， 10(0.00，30.00)；LeeⅣ组,6.5(0.00，20.00)， 12(0.00，31.00)；LeeⅤ组,16(13.00，23.00)， 23(12.00，32.00)；可见在不同Lee分级IgAN患者组中免疫酶化学法测得的足细胞中位数值比免疫荧光法测得的足细胞中位数值高。免疫荧光细胞化学染色，足细胞胞浆为明亮的翠绿色，细胞核位置呈黑色；免疫酶细胞组织化学染色，足细胞胞浆染色显棕色沉积为阳性，胞核圆形，染成蓝色，见图1(插页六)。

2.3 2种方法检测IgAN患者尿足细胞数的相关性分析 2种方法检测的尿足细胞数呈正相关关系(r=0.842，Plt;0.01)。见图2。

3 讨 论

IgAN是以肾小球系膜区大量IgA 或以IgA 为主的免疫球蛋白沉积为主要特点的临床最常见的原发性肾小球肾炎，是导致ESED的主要原因之一。其临床表现多样，肾脏病理活检形态不一，预后也相差悬殊。据统计，IgAN约占我国原发性肾小球疾病的30% ～ 40%，而且每10 年约有20%的患者会进展到慢性肾衰竭[10]。经皮肾穿刺活检是确诊肾脏疾病的最可靠方法，也是诊断肾病的金标准[11]。但肾活检是一项有创的检查方法，因受客观条件的限制，部分患者不能进行肾脏活检，而且肾活检也难以用于动态追踪观察，这无疑给肾脏疾病的早期诊断和病情追踪带来困难。尿蛋白是临床通常使用的观测指标，研究[12]证实：足细胞位于肾小球毛细血管壁最外层,以其次级突起即足突和基底膜相连,足突间有裂隙隔,其上覆盖的裂隙隔膜是构成肾小球血液滤过屏障的主要成分。足细胞受损后从肾小球基底膜脱落,导致滤过膜的完整性被破坏,是蛋白尿发生的病理基础之一,因此尿足细胞的情况能预测蛋白尿的发生和程度[13-14]，检测尿足细胞是新近发展起来的一项无创检查,该无创性检测方法在评估肾脏病理的类型、指导临床治疗和判断愈后的临床应用价值倍受关注。沈沛成等[15]认为：尿足细胞阳性的IgAN患者系膜基质增多、间质纤维化和足突融合的程度明显重于尿足细胞阴性患者,而系膜细胞增生、新月体、基底膜增厚、血管襻坏死、间质炎症细胞浸润和小管萎缩的程度两者间差异并无统计学意义。前组指标(包含系膜基质、间质纤维化和足突融合)反映的是病变的慢性化程度,而后组指标(包含系膜细胞增生、新月体、基底膜增厚、血管襻坏死、间质炎症细胞浸润和小管萎缩)多为急性活动性病变,经积极治疗后可逆转。由此可见,尿足细胞阳性的IgAN患者的病程多呈进展性,动态观察尿足细胞数的变化对判断病情的发展和疾病的预后有一定的帮助。本文作者[16]曾经用免疫酶细胞化学染色法就IgAN患者肾脏病理Lee氏分级各组研究对象尿足细胞的排泄特征和肾组织PCX表达进行探讨，发现IgAN患者肾脏病理Lee氏分级各组研究对象尿足细胞数组间比较差异有统计学意义，IgAN患者Lee氏Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分级组尿足细胞中位数和阳性率分别高于Lee氏Ⅰ和Ⅱ分级组研究对象尿足细胞中位数和阳性率，证明IgAN患者有尿足细胞的损伤，且尿脱落足细胞对IgAN患者病程有一定预测性，尿足细胞检测可作为IgAN的一项临床无创检查的指标。虽然尿足细胞检测在临床实践中的应用还有很多问题需要进一步研究和探索，但是已有的众多研究支持尿足细胞成为一种有用的非侵袭性的肾小球疾病活动性的标记，因此，今后需要更大规模的临床前瞻性研究证实尿足细胞在肾小球疾病诊断中的有效性，故尿足细胞检测的方法尤为重要，这直接关系到检测结果的可靠性和准确性。本研究针对IgAN患者，连续3 d收集患者治疗和诊断前的晨尿标本，每个患者均做平行对照，且每个患者涂片均用2种方法记数足细胞，目的就是为了提高结果的准确性，本研究结果表明：2种方法均能很好地检测出IgAN患者尿中的足细胞，2种方法平行检测IgAN各Lee氏分级研究对象结果一致，2种方法具有良好的相关性，虽然免疫荧光细胞化学染色方法简单易行且其结果镜下易辨认，但其阳性率和中位数值可能受尿液成分的影响，尤其是一些破碎细胞、盐类结晶和黏液丝等易与尿中足细胞黏连或被掩埋导致荧光着色显著减弱[17]，或由于尿沉渣中充满的红细胞或管型在细胞离心涂片后也被固定和染色，其存在能导致较强的荧光信号，影响足细胞计数[18]，而免疫酶细胞化学染色检测的尿足细胞阳性率和尿足细胞中位数值均高于免疫荧光细胞化学染色检测的尿足细胞阳性率和尿足细胞中位数值，且不需要荧光显微镜，方便基层开展，受其他成分干扰小，且由于免疫酶细胞染色方法本身有第二步放大效应，结果好辨认，也适用于保存和反复计数，故本文作者认为免疫酶细胞染色是检测尿足细胞数较好的一种方法，值得推广应用。

图2 2种方法检测尿足细胞数的相关性

Fig.2 Correlation between urinary podocyte count of IgAN patients detected by two kinds of method

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Comparisonofeffectbetweenimmunoenzymaticcelluarchemistryandimmunofluorescencecelluarchemistryindetectingurinarypodocytes

JIANG Wen-ling,PENG You-ming,LIU Hong,XIA Yun-cheng,LIU Fu-you

(Department of Nephrology,Institute of Nephrology,Second Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410011,China)

ObjectiveTo compare the effects of immunofluorescence and immunoenzymatic celluar chemistry in detecting the urinary podocytes of IgA nephropathy (IgAN) patients and to provide basis for selecting the detection method of urinary podocytes.Methods200 mL morning urine samples were collected from 43 cases who diagnosed as IgAN (experiment group) and 10 cases of normal control subjects (control group) for 3 consecutives days before renal biopsy,and the smears were made from the supernatant by centrifugation.The IgAN patients were classified into Lee Ⅰ -Lee Ⅴ groups according to Lee degree method.Immunofluorescence and immunoenzymatic celluar chemistry with monoclonal anti-podocalyxin(PCX) antibody were performed to detect the urinary podocytes and the number of urinary podocytes was counted by fluorescence and optical microscope;the correlation between the number of urinary podocytes detected by two kinds of methods were analyzed by Spearman correlation analysis.ResultsThere were no urinary podocytes of the objects in control group detected by two kinds of methods,but in experiment group they were visible;the positive rate and the median of urinary podocytes detected by immunofluorescence celluar chemistry were lower than those detected by immunoenzymatic celluar chemistry (Plt;0.05);there was a positive correlation between two kinds of methods(r=0.842，Plt;0.01).ConclusionImmunoenzymatic celluar chemistry is more effective compared with immunofluorescence celluar chemistry in detecting the urinary podocytes.

immunoenzymatic celluar chemistry;immunofluorescence celluar chemistry;podocyte;urine

1671-587Ⅹ(2013)06-1242-05

10.7694/jldxyxb20130633

2013-05-06

国家自然科学基金资助课题(81170663)

姜文玲(1972-)，女，山东省烟台市人，主管技师，医学硕士，主要从事肾脏病临床检验和病理研究。

彭佑铭(Tel：0731-85293584， E-mail:pengym5577@yahoo.com.cn)

R544.14

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