电针对大鼠脑缺血再灌注后早期功能恢复及VEGF表达的影响*

韩永升 韩咏竹△ 徐 磊 刘向国 付晓明 胡纪源

（1.安徽中医学院神经病学研究所附属医院，安徽 合肥 230061；2.蚌埠医学院第一附属医院，安徽 蚌埠 233004；3.安徽中医学院中西医结合临床学院，安徽 合肥 230038）

缺血性脑血管病是威胁人类健康的重大疾病，研究表明当脑缺血发生时，缺血侧半球血管新生增加，这些增加的血管可能来自于脑血管内皮细胞的增殖形成的新生毛细血管［1-2］。为进一步了解电针早期治疗缺血性脑血管的机制，笔者通过探讨电针早期治疗对大鼠脑梗死灶周围血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响，为临床应用电针早期治疗缺血性脑血管病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 分组选取健康成年雄性SD大鼠48只，体质量250～280 g，由上海西普尔-必凯验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验条件下自然饲养，预适应环境1周后进行实验。大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、电针组各16只。每组又分为7、14 d两个亚组，每个亚组各8只。

1.2 仪器与试剂 上海产G6805电针仪；德国徕卡RM2016轮转式切片机；日本OlympusBX51显微镜；免疫组化试剂盒SP-9000购自北京中杉金桥生物技术有限公司；VEGF抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 模型制备 采用Zea Longa［3］方法并加以改进，制备急性脑缺血再灌注大鼠模型。假手术组只分离动脉，不结扎、插线。大鼠苏醒后参照 Zea Longa［3］方法评分。0分：未见神经病学征象，无神经功能缺损症状。1分：大鼠被提尾倒悬时，病灶右侧前肢呈屈曲、抬高状态，不能伸展右侧前爪。2分：有向瘫痪侧旋转的征象，即行走右侧转圈。3分：有向病灶对侧跌倒的征象，即行走困难并向右侧倾倒。4分：不能自发行走，意识水平呈下降状态。达到1～3分为造模成功，采用差额补充的方法以保证每组实验动物例数。

1.4 干预方法 电针组：造模成功后用自制鼠夹固定，不麻醉。根据华兴邦等［4］制定的大鼠针灸穴位图谱，选穴双侧内关（手厥阴心包经）、水沟（督脉）、双侧三阴交（足太阴脾经）、百会（督脉）。采用苏州产华佗牌毫针，规格为直径0.2 mm，针身0.25～0.5寸。先直刺双侧内关1 mm至筋间，继刺水沟，在鼻中隔下部向上斜刺水沟1 mm，其次刺三阴交，直刺5 mm，最后向前或向后斜刺百会穴2 mm，留针30 min，留针期间将内关、三阴交穴位针柄分别连接至G6805电针仪，施以疏密波，频率2/100 Hz，电压2～4 V，强度逐渐加大到大鼠针刺部位轻微抖动为度，首次针刺在动物造模成功90 min后进行，其后每日上午针刺1次，每7日为1个疗程。模型组、假手术组：常规饲养于笼内，不进行任何干预治疗。

1.5 指标检测

1.5.1 神经功能评定 参照Zea Longa［3］神经功能评分标准评分。在造模成功第7日、14日分别进行神经功能评分，观察其运动功能恢复情况。

1.5.2 标本采集与检测 各组大鼠分别于7 d，14 d，随机取8只。用6%水合氯醛腹腔内注射麻醉后固定于手术台，剪开胸腔，仔细剪开心包膜，暴露心脏，在心尖处剪一小切口，用9号针头插入左心室，灌注0.9%氯化钠注射液，待右心耳膨起，剪开右心耳使血液流出，至右心耳流出液为无色透明时开始用4%多聚甲醛灌注固定。固定后立即剖颅取脑，在视交叉处切开，冠状切取2 mm厚包含梗死灶区域及左右半球的组织块浸于4%多聚甲醛中再固定。在梗死区取约0.5 mm厚脑组织50%、75%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水；二甲苯透明；浸蜡包埋。连续冠状切片，切片厚5 μm。切片备用。（1）脑组织HE染色：石蜡切片常规脱蜡入水后，将切片置于苏木素染液中5 min染色，水洗去多余染料；将切片先后置于碳酸锂溶液与1%盐酸酒精中数秒至细胞核变蓝；再置1%伊红水溶液中浸泡5 min，梯度酒精脱水、二甲苯透明，最后用中性塑胶封片，Olympus BX51显微镜下观察并摄片。（2）免疫组织化学染色：使用SP方法检测大鼠脑组织中VEGF的表达。免疫组化染色步骤如下。①石蜡切片经常规脱蜡脱水；②热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），电炉加热至沸腾后断电，间隔5 min后再加热至沸腾，反复2次；室温冷却后，0.1 mol/L PBS洗涤2次；③置于3%H2O2去离子水孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗，每次3 min，共3次；④滴加试剂A（正常山羊血清）封闭液室温孵育15 min，倾去；⑤分别滴加1∶200比例稀释的一抗GAP-43、Nogo-A，4℃过夜，PBS冲洗，每次 3 min，共 3次；⑥滴加试剂B（生物素标记山羊抗兔IgG），37℃孵育15 min，PBS冲洗，每次 3 min，共3次；⑦滴加试剂 C（辣根酶标记链酶卵白素工作液），37℃孵育15 min，PBS冲洗，每次3 min，共3次；⑧滴加DAB显色试剂，室温显色，显微镜下控制反应时间，显色后，蒸馏水洗涤终止反应。⑨苏木素轻度复染，自来水水洗；1%盐酸酒精稍分色后兰化片刻；常规脱水、透明、中性树胶封片。用正常山羊血清替代一抗作阴性对照。Olympus BX51显微镜观察并摄片，采用JD801形态学图像分析系统对VEGF的表达进行分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件。计量资料以（）表示，成组、成对资料均数比较采用t检验，多组间比较采用onewayANOVA分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 见表1。假手术组大鼠无神经功能缺损症状。模型组和电针组比较，造模成功7 d，神经功能评分差异无统计学意义（P＞0.05），14 d时电针组大鼠神经功能恢复明显优于模型组（P＜0.05）。

2.2 脑组织病理改变 见图1。电针治疗14 d时，假手术组大鼠脑组织灰、白质界限清楚，无缺血坏死区，组织结构正常，胞膜完整，胞浆着色均匀，细胞核清楚，核仁明显；海马结构正常，神经细胞排列整齐紧密。模型组大鼠脑组织灰质区部分神经细胞及胶质细胞坏死、消失，白质区部分神经纤维液化坏死；海马神经细胞排列紊乱，数量减少，细胞变形。电针组大鼠脑组织白质部分神经纤维轻度液化坏死，灰质区少量神经细胞及胶质细胞坏死，坏死区胶质细胞广泛增生。海马神经细胞排列较整齐，数量轻度减少。

表1 各组大鼠缺血再灌注后神经功能评分比较（分，）

表1 各组大鼠缺血再灌注后神经功能评分比较（分，）

与模型组同时期比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组同时期比较，△P＜0.01。下同。

图1 各组大鼠14 d时脑组织病理变化（HE，×400）

2.3 各组大鼠再灌注区脑组织VEGF表达比较 见表2。在假手术组中见少量VEGF阳性表达，模型组在脑梗死模型建立7 d时，脑缺血区VEGF阳性表达增加；14 d时明显增加，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。电针组在各个时间点VEGF阳性表达较模型组明显增加，与模型组比较有明显差异 （P＜0.01）。

表2 各组大鼠脑内VEGF表达比较（）

表2 各组大鼠脑内VEGF表达比较（）

3 讨 论

本研究大鼠针刺选用天津中医药大学石学敏院士创立的“醒脑开窍”针刺法。该针法的主要穴位水沟、内关、三阴交可促进脑的代谢和修复，改善大脑的生理功能，达到“醒神开窍”之功。百会穴具有醒脑开窍、安神定志、升阳举陷的作用。对中风偏瘫患者的大脑皮层的中枢生物电有良好的调节作用。故本次实验选取水沟、内关、三阴交为主穴，百会为配穴。有研究表明［5-6］，电针刺激水沟穴、百会穴及内关穴，疗效明显。因此本研究选用电针方法以量化针刺强度，改善疗效。

神经行为学评分是脑梗死诊断和疗效评价的一个重要指标。本次实验神经功能评估参照Zea Longa［3］神经功能评分标准评分。将各个亚组的大鼠在各个时间点灌注之前进行神经功能评分。结果提示电针组大鼠神经功能恢复明显优于模型组，说明电针可以明显促进大鼠局灶性脑缺血模型的神经功能恢复。

VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原和血管源性因子，可诱导内皮细胞增殖及毛细血管瓣生成，促进新生血管生成。VEGF不仅可以诱导内皮细胞的增殖、促进微血管的形成，还能直接作用于多种类型的神经细胞，发挥神经营养及保护作用，可增强细胞活性和存活能力，并能促进轴突再生［7］。VEGF在正常脑组织中仅有少量表达，脑缺血发生后，促使VEGF表达升高，特别在海马、皮质对缺血敏感的神经元。本研究表明，缺血早期内皮细胞增生，免疫组织化学染色发现VEGF表达于星形胶质细胞、神经元及血管内皮细胞，可见血管增生，说明VEGF有促进血管新生作用，有利于侧支循环的建立；神经元及星形胶质细胞可分泌VEGF，提示可能有促进内皮细胞增生的作用，与以往研究一致［8］。本研究表明，缺血组大鼠VEGF在缺血14 d达到高峰，1～3个月VEGF表达有下降趋势，提示机体自身修复可能达到一个相对平衡状态。假手术组仅见少量的VEGF表达，但模型组在7、14 d的VEGF表达明显高于假手术组，说明在脑缺血发生后VEGF会参与神经损伤部位血管的再生，促进神经再生和神经保护作用。电针组在7、14 d的VEGF表达均高于模型组，进一步提示了电针在改善脑局灶性缺血再灌注大鼠神经功能中的重要作用，揭示电针治疗脑梗死的作用机制，可能是通过诱导细胞表达VEGF而实现的。

［1］Manoonkitiwongsa PS，Jackson FC，McMillan PJ，et al.Angiogenesis after stroke is correlated with increased numbers of macrophages：the clean-up hypothesis［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2001，21（10）：1223-1231.

［2］Zhang ZG，Zhang L，Jiang Q，et al.VEGF enhances angigenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain［J］.J Clin Invest，2000，106（7）：829-838.

［3］Zea Longa E，Weistein PR，Calson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］华兴邦，周浩良，李辞荣，等.大鼠穴位图谱的研制［J］.实验动物与动物实验，1991（1）：1-5.

［5］Fei Zhou，Jingchun Guo，Jieshi Cheng，et al. Electroacupuncture increased cerebral blood flow and reduced ischemic brain injury：dependence on stimulation intensity and frequency［J］.J Appl Physiol，2011，111：1877-1887.

［6］王世军，崔可密，卢岩，等.针刺对MCAO大鼠海马CA3区微血管数目及神经元死亡率的影响［J］.山东中医药大学学报，2005，29（1）：59-60.

［7］Fan Y，Yang GY.Therapeutic angiogenesis for brain ischemia：A brief review［J］.Neuroimmune Pharmacol，2007，322：521-528.

［8］Guo S，Kim WJ，Lok J，et a1. Neuropeotection viamatrix- trophic coupling between cerebral endothelial cells and neurons ［J］. Proe Natl Acad Sel USA，2008，105：7582-7587.