益气活血方对大鼠肺组织基因表达谱的影响*

刘 欣 王炳胜 刘秀芳 张 海 李凤玉 张建宇 葛艳丽 李卫威

（1.河北北方学院，河北 张家口 075000；2.解放军第二五一医院，河北 张家口 075000）

数字化基因表达谱（Digital Gene Expression Profile）是利用新一代高通量测序和高性能的计算机分析技术，全面、经济、快速地检测某一特定组织在特定状态下的基因表达情况，这一技术已被广泛应用于疾病发病机制、药物研发等研究领域。研究表明，益气活血方能够降低放射性损伤相关细胞因子的表达，降低其发生率，减轻其症状持续时间［1-4］，是肿瘤放化疗患者良好的辅助用药，但其作用的分子机制不明确。本实验采用数字化基因表达谱分析益气活血方对大鼠肺组织基因表达的影响，从而了解益气活血方作用的分子机制，为该药在临床上推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 20只健康雌性成年Wistar大鼠20只，体质量（200±20） g，许可证号 scxk（京 2012-0001），合格证号026150，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。在SPF级实验室饲养3 d，无异常者入组者实验。

1.2 试剂及仪器 主要试剂为Illumina Gene Expression Sample Prep Kit和Illumina测序芯片（flow-cell）；主要仪器为Illumina Cluster Station和Illumina HiSeq 2000系统。

1.3 药物 益气活血方，组方：黄芪30 g，党参25 g，白术 15 g，茯苓 15 g，丹参 30 g，鸡血藤 30 g，地龙 15 g，川芎 15 g，当归 20 g，苦参 30 g，香附 30 g，麦冬 15 g，枇杷叶15 g，紫金牛10 g。药材水煎、醇沉、浓缩、分装、消毒备用，生药含量2 g／mL。

1.4 分组与造模 将大鼠随机分为益气活血方组10只（中药组）、空白对照组10只（对照组）。中药组大鼠每日灌胃益气活血方1 mL，对照组每日灌胃蒸馏水1 mL，直至动物被处死取材。

1.5 标本采集 两组大鼠分别于首次灌胃起第6、12周末，各随机抽取5只，用戊巴比妥钠0.04 g/kg腹腔麻醉后立即开胸取其右肺组织，并保存于-80℃冰箱备用。

1.6 数字化基因表达谱信息分析流程

1.6.1 Tag的制备 提取 6 μL总 mRNA，利用Oligo（dT）磁珠吸附纯化 mRNA，并以 Oligo（dT）引导反转录合成双链cDNA。采用四碱基识别酶NlaⅢ，识别并切断cDNA上的CATG位点，利用磁珠沉淀纯化带有cDNA 3'端的片段，将其5'末端连接Illumina接头1。利用MmeI酶切CATG位点下游17 bp处，通过磁珠沉淀去除3'片段后，在Tag3'末端连接Illumina接头2，从而获得两端连有不同接头序列的21 bp标签library。经过15个循环的PCR线性扩增后，通过6%TBEPAGE胶电泳纯化95碱基条带，解链后，单链分子被加到Illumina测序芯片（flowcell）上并固定，每条分子经过原位扩增成为一个单分子簇 （cluster）测序模板，加入4色荧光标记的4种核苷酸，采用边合成边测序法（SBS）测序。测序得到的原始图像数据经basecalling转化为序列数据，称为原始Tag。

1.6.2 Clean Tag 原始序列带有一段3'adaptor序列，并且含有少量低质量序列以及各种杂质成分。经过一系列数据处理，得到Clean Tag。

1.6.3 基因表达注释 经过测序质量评估、测序饱和度分析、实验重复性分析、Cleantag拷贝数分布统计、Clean Tag比对统计等一系列处理后对基因表达进行注释。

1.6.4 差异基因的筛选 参照文献［5］的数字化基因表达谱差异基因检测方法，开发了严格的算法筛选两样本间的差异表达基因。在本次分析中，差异表达基因定义为FDR≤0.001且倍数差异在2倍以上的基因。通过对Gene Ontology功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析、差异基因表达模式聚类分析等一系列后续处理后得出结果。通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生学功能。

2 结 果

中药组对比对照组在6周末差异表达基因为1338个，其中上调基因为705个，下调基因为633个。以corrected-pvalue≤0.05为标准，找出显著富集的GO条目，发现这些基因主要和细胞代谢过程相关。通过差异基因表达模式聚类分析得出：6周末上调基因主要与细胞分裂增殖相关，下调基因主要与脂代谢、炎症因子相关。12周末差异表达基因为2001个，其中上调基因为755个，下调基因为1226个。以correctedpvalue≤0.05为标准，找出显著富集的GO条目，发现这些基因主要应激反应、免疫过程、细胞代谢过程的调控相关。通过差异基因表达模式聚类分析，笔者得出上调基因主要与免疫、DNA损伤修复相关，下调基因主要与脂代谢、炎症因子、纤维化功能相关。从中找出特异性差异表达基因，见表1、表2。

表1 6周末差异表达基因

表2 12周末差异表达基因

3 讨 论

益气活血方是由笔者经过多年的临床实践研制出来的具有补气养阴、活血化瘀等功效的方剂，主要用于防治辐射损伤。药理研究表明，当归、川芎能对抗辐射损伤；黄芪具有调节免疫、清除自由基的作用［6］；党参能够上调细胞外超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的表达［7］；丹参具有抗血小板聚集、改善微循环等作用；苦参能抑制成纤维细胞的增殖活力及DNA合成［8］；香附、当归、川芎、地龙具有提高机体免疫力、非特异性抗炎等作用［9］。

成纤维细胞生长因子-2可以诱导新生血管的形成［10］，能够促进骨组织、软骨组织及神经组织损伤修复和再生［11］。中药组大鼠肺组织在给药后6周及12周均有成纤维细胞生长因子受体结合蛋白的高表达，间接表明益气活血方可以通过增加成纤维细胞因子的表达，从而诱导血管生成，促进组织修复和再生。

肿瘤坏死因子是一种多功能的细胞因子，主要介导免疫及炎症反应。多数学者认为肿瘤坏死因子、转化生长因子等诱导的早期炎症反应及晚期肺纤维化是放射性肺损伤发生的主要机制［1］。中药组大鼠肺组织在给药6周、12周时均有肿瘤坏死因子受体基因、低密度脂蛋白受体相关蛋白基因的下调，表明益气活血方可以减轻减少辐射损伤相关炎症因子的表达，降低血液黏稠度，从而减轻炎症反应，改善微循环。

XRCC5及XRCC6均是DNA损伤修复基因，XRCC5是修复DNA双链断裂的基因，放射线照射后XRCC5的mRNA高表达［12］，辐射抗性小鼠高表达XRCC5基因［13］。益气活血方应用 12周后可以使 XRCC5、XRCC6基因高表达，表明该药可以提高大鼠的抗辐射能力，从而减轻辐射损伤。

白介素-17（IL-17）可以刺激粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的分泌，介导免疫系统和造血之间的相互作用，并能够刺激白介素-6和前列腺素-E2的产生，加强局部炎症反应［14］。白介素-22（IL-22）在炎症与免疫反应中发挥重要作用，有研究表明在急性泛发性发疹脓包病中外周血中的IL-22和IL-17表达量明显提高，它们共同刺激角质细胞产生白介素-8从而促进中性粒细胞在急性泛发型脓疱表皮中聚集［15］。益气活血方应用12周时IL-17受体基因、IL-22受体基因下调，表明益气活血方可以调节炎症相关因子的基因表达，从而减轻放射性损伤。

层黏连蛋白可以结合多种整合素及胶原蛋白，与纤维化形成有关。益气活血中药应用12周后可以降低整合蛋白α及层黏连蛋白基因的表达，表明益气活血方能预防纤维化的形成。

综上所述，益气活血方可以调控脂代谢、炎症因子、免疫功能、DNA损伤修复、纤维化相关基因的表达，从而调节调节机体代谢，加强细胞增殖及分裂，降低血液粘稠度，改善微循环，从而对机体起到保护作用。长期应用可以调节机体免疫功能，降低炎症相关因子的表达，并提高机体抗辐射能力，有一定的抗纤维化作用。这也是该方具有降低放射性肺损伤发生率，减轻放射性肺损伤，改善患者临床症状及其持续时间的分子生物学机理。

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