截短NDV F 蛋白的原核表达

王杰，王宇鹏，刘振格，杨鸣发，林红丽，田斌，侯喜林

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种高度接触性传染病。NDV 属副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属[1-2]，禽副粘病毒Ⅰ型（APMV-Ⅰ），是一种有囊膜的单链负股RNA 病毒。

新城疫病毒的感染能力主要是由两个外膜蛋白决定的；一个是血凝素神经氨酸酶（HN），另一个是融合蛋白（F）。HN 蛋白参与病毒粒子与宿主细胞表面受体吸附过程，F 蛋白介导病毒与宿主细胞膜之间发生融合，进而使病毒侵入宿主细胞，达到致病的目的[3]。据报道，在鸡的被动免疫过程中，相应的单克隆抗体可以直接作用于F 蛋白的2 个抗原表位，抑制病毒增殖，从而成功的预防了由该病毒导致的鸡的死亡[4]。因此，HN 蛋白和F 蛋白成为目前亚单位疫苗和基因疫苗研究的首选抗原[5-6]。

由于F 蛋白的结构比较复杂，在原核表达系统中很难获得全蛋白的高效表达，所以本研究根据已知的F 蛋白的3 个中和抗原表位（第72、161 和343个氨基酸残基上），对NDV LaSota 株F 蛋白基因的三个抗原表位进行分段克隆，期望在原核表达系统中获得高效表达。并对重组蛋白进行检测与分析，为以后NDV 的诊断方法和疫苗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌种、载体

NDV LaSota 弱毒疫苗株购自哈尔滨维科生物技术开发公司（生产批号：080012040），E.coli DH5α 和BL21（DE3）由本实验室保存，原核表达载体pET-30a（+）由本实验室保存，克隆载体pMD18-T 购自于大连宝生物工程有限公司。

1.1.2 主要试剂

BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司；T4 DNA 连接酶购自Promega 公司；胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自北京索莱宝公司；NDV 标准阳性血清购自哈尔滨兽医研究所，HRP 标记的羊抗鸡IgG-购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.1.3 引物设计

参照GenBank 中已发表的LaSota（登陆号：AF077761.1）株的F 基因，设计两对特异性引物，在每对引物的上、下游5′端加入保护性碱基和BamH Ⅰ、Hind Ⅲ限制性内切酶切位点（酶切位点用下划线标出），送往上海生工生物技术有限公司合成。引物序列如下：

表1 PCR 反应引物Table 1 Primers for PCR

1.2 方法

1.2.1 F780和F760片段的扩增

提取鸡胚尿囊液中（NDV 标准LaSota 株）的RNA，反转录成cDNA。RT-PCR 扩增体系如下：ddH2O 18.3 uL；La Taq Buffer 2.0 uL；dNTP（2.5 mM）2.0 uL；上下游引物各1.0 uL；模板cDNA 0.5 uL；La Taq 0.2 uL。F780反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃40 s，62 ℃40 s，72 ℃40 s，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。F760反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃40 s，61 ℃40 s，72 ℃45 s，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检查结果。

1.2.2 PCR 产物的克隆与测序

PCR 产物采用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收目的片段，将回收的目的片段连接到pMD18-T 载体上，转化DH5α 感受态细胞中，均匀涂布于LB/AMP+固体培养基上，37 ℃培养过夜，至出现单个菌落。挑取阳性单个菌落经BamHⅠ、Hind Ⅲ限制性内切酶双酶切鉴定，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.3 重组表达载体的构建

将实验室保存的pET30a（+）质粒经BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶进行双酶切，将酶切产物回收，获得目的片段。将目的片段与载体片段进行连接，采用10 μL 连接体系：10×T4 ligase Buffe 1.0 μL，T4 DNA ligase 0.5 μL，目的片段6.0 μL，pET30a（+）载体2.5 μL。22 ℃水浴连接过夜。将连接产物转入BL21 感受态细胞中，冰水浴30 min，42 ℃水浴热休克90 s，立即冰浴2 min，然后加入800 uL 预热的LB无抗性液体培养基，37 ℃220 r·min-1摇床上振荡45～60 min，5 000 r·min-1离心5 min，弃上清，留下约100～200 μL 菌液混匀后，均匀涂于含Kan+的LB 平板上，放置37 ℃培养箱中培养过夜。

1.2.4 重组菌的诱导表达

将阳性重组菌和空载体分别接入到含Kan+的LB 液体培养基中，37 ℃培养，当OD600达到0.5～0.8时，在菌液中加入IPTG（终浓度为1 mmol·L-1），进行诱导表达。分别在诱导后3、5 小时取出1 mL 菌液，经SDS-PAGE 分析，观察结果。

1.2.5 Western blot 鉴定

重组蛋白经SDS-PAGE 电泳后，将其转移到NC膜上。将转移成功的NC 膜浸入5%脱脂乳中，置于水平摇床上4 ℃封闭过夜，次日用PBST 洗涤3 次；每次10 min，将膜浸入1∶500 稀释的NDV 多抗血清中，室温作用2 h，洗涤3 次；将膜浸入以1∶2000 稀释的HRP 标记的羊抗鸡IgG 中，室温缓慢振荡1 h，在DAB 中显色并观察结果。

2 结果

2.1 RT-PCR 扩增结果

利用两对特异性引物对NDV LaSota 疫苗株F基因进行RT-PCR 扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，分别在705 bp 和624 bp 出现两条清晰的条带，与预期的目的片段大小一致，结果见图1。

图1 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 重组表达质粒pET30-F760、pET30-F780 PCR 和双酶切鉴定结果

重 组 质 粒pET30-F760、pET30-F780经BamH I、Hind Ⅲ限制性内切酶双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分析后，得到5422 bp 的pET30 载体片段和两条大小为705 bp 和624 bp 的目的片段（图2），结果表明目的片段已经克隆到pET30a（+）表达载体上，成功构建了pET30-F760、pET30-F780原核表达系统。

图2 重组质粒pET30-F760、pET30-F780 的双酶切鉴定Fig.2 Identification of pET30-F760、pET30-F780by enzyme digestion

2.3 重组蛋白的SDS-PAGE 结果

经IPTG 诱导后，重组蛋白经12% SDS-PAGE分析后，清晰可见大小分别为27.9 kDa 和31.1 kDa的蛋白条带，大小与目的蛋白的理论值一致（图3）。

图3 重组质粒pET30-F760、pET30-F780表达产物SDS 分析结果Fig.3 SDS-PAGE results of the pET30-F760 and pET30-F780 recombinant protein expressed

2.4 重组蛋白的Western blot 鉴定结果

将经过SDS-PAGE 电泳后获得的目的蛋白条带转印到NC 膜上，以鸡源抗NDV 阳性血清作为一抗，以HPR 标记的羊抗鸡IgG 作为二抗，最后经DAB 显色，在相对分子量约27.9 kDa 和31.1 kDa 处各出现一条明显的棕色条带，与预计的目的片段大小一致，而阴性对照并未出现任何条带（图4）该结果说明表达的重组蛋白具有良好的免疫反应性。

图4 重组蛋白的Western blot 检测结果Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein

3 讨论

由于NDV F 蛋白结构的复杂性，在原核表达系统中很难获得F 基因的全长表达。冉旭华[7]曾尝试将NDV F48E8 株的完整的F 蛋白进行表达，结果没有成功。孙淑娜[8]也曾尝试表达LaSota 株的F 蛋白，却得到了同样的结果。在后续的研究中张桂芝将（F48E9）的F 蛋白去掉了N 端信号肽和C 端跨膜区，并根据F 蛋白已知的三个抗原表位的位置，分别位于第72、161 和343 个氨基酸残基上，将F 蛋白分成两段进行原核表达。程宝艳[9]则将三个抗原表位分别单独表达，结果二者都成功的获得了截断蛋白的高效表达。研究对NDV LaSota 株F 蛋白基因的三个抗原表位进行了分段克隆，通过大肠杆菌原核表达系统进行表达。成功的获得的截断蛋白的高效表达。并通过研究了解NDV 部分抗原表位的特点，为以后NDV F 蛋白在亚单位疫苗方面的研究奠定基础。

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