新疆塔吉克族健康人群脂蛋白脂酶HindⅢ基因多态性研究

祖克拉·肉孜，伊力哈木·乃扎木，宋曼殳，多力坤·买买提玉素甫＊

（1.新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐830046；2.首都医科大学 公共卫生与家庭医学学院）

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是由脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等实质细胞合成和分泌的一种配置甘油水解酶，可将极低密度脂蛋白和乳糜微粒的甘油三酯（TG）水解为分子量较小的脂肪酸，从而血液甘油三酯浓度降低。LPL基因全长30 kb，含有9个内含子和10个外显子［1］，第8位内含子的HindⅢ酶切位点的多态性使LPL基因有三种基因型。LPL是基因突变最为丰富的蛋白质之一，其突变位点涉及外显子、内含子和启动子，目前已经证实LPL突变已达110余种。LPL基因多态性通过影响LPL活性，导致脂质代谢和糖代谢紊乱，从而与高脂血症、Ⅱ型糖尿病、高血压、动脉硬化、肥胖及冠心病等疾病的发病风险相关联［2，3］。因此，研究LPL基因，对于探索这些疾病的相互关系、发病机理及其防治都具有积极的意义。近年来对LPL基因多态性研究发现，不同种族间基因多态性的分布可能存在差异，有关LPL基因HindⅢ多态性分布在中国老年人群、白种人、日本人中差异有报道［4］，但有关新疆地区塔吉克族健康人群LPL基因HindⅢ酶切位点多态性分布的研究目前尚未见研究报道。本研究分析了塔吉克族人群中LPL基因多态性的分布，为进一步研究LPL基因多态性与相关疾病发病危险性和前瞻性研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

在塔吉克族正常人群中经过体格检查及辅助检查，选取塔吉克族91人（男36例，女56例）。年龄15－90岁，平均年龄为42岁。对调查对象进行详细询问按项目内容逐项填写，病史询问主要排除高血压病，糖尿病，心脑血管疾病，肿瘤等目前被证实与遗传有关的疾病。

1.2 方法

应用聚合酶链反应（PCR）等技术检测无血缘关系的91例（男性36，女性55）塔吉克族LPL基因多态性，并结合统计学软件分析其分布特点。

1.2.1 基因组DNA提取 取4℃下保存的含EDTA血样，加入淋巴细胞提取液，进行淋巴细胞分离，具体操作按说明书进行（淋巴细胞提取液购于鼎国公司）。然后采用盐析法从分离的淋巴细胞中提取DNA。

1.2.2 PCR 扩增 参照文献［5］设计引物。HindⅢ上游引物：5’－TTCGCCATTCAGAAGATCAG－3’，下游引物：5’－GTGATACAAGCAAATGACTAAAG－3’；引物由上海生工合成。PCR试剂盒购于TaKaRa公司，PCR反应体系为25μl，其中包含100ng基因组DNA，1UTaq DNA聚合酶，引物各10pmol／L，4×dNTP（10mmol／L）为2.5μl，10×PCR buffer为2.5μl，MgCl2（25mmol／L）为1.5μl，加去离子水补至终体积25μl。反应条件：94℃4min预变性，94℃90s，52℃60s，70℃90s，循环次数40次；70℃延伸5min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测扩增结果。

1.2.3 基因分型 PCR产物用HindⅢ限制性内切酶酶切，37℃消化过夜，消化片段经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，凝胶成像系统（美国Bio－Rad Gel Dox XR）拍照并判断酶切结果。

1.2.4 酶切产物电泳 取PCR扩增产物5μl，在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外照射仪上观察结果。

1.2.5 统计学分析 经过Hardy Weinberg遗传平衡定律检验各基因型频率是否达遗传平衡［6］，具有群体代表性。利用SPSS 17.0软件进行统计分析，基因型分布及等位基因频率比较用χ2检验。

2 结果

2.1 电泳结果

由图1可见，LPL基因HindⅢ位点PCR扩增片段为645bp，经HindⅢ限制性内切酶水解后可得三种长度的多态性片断，H＋H＋基因型（645bp，无HindⅢ酶切位点）；H＋H－基因型（645bp，528 bp，117bp）；H＋H＋基因型（528bp，117bp）。

图1 脂蛋白酯酶基因HindⅢ 酶切位点多态性

2.2 基因型频率

由表1可知两组人群LPL基因型及等位基因频率经χ2检验，比例符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。男女间基因型和等位基因频率分布均无显著性差异（P＞0.05）。

表1 塔吉克族91例健康人群LPL HindⅢRFLP分布

2.3 不同地区（不同民族）健康人群LPL HindⅢ位点基因型分析

由表2可知：广西人与吉林汉族人比较差异无统计学意义（基因型：χ2＝0.652，P＝0.722等位基因：χ2＝0.639，P＝0.024）。广西壮族人与朝鲜族比较差异有统计学意义（基因型：χ2＝7.786，P＝0.032等位基因：χ2＝8.784，P＝0.003）。吉林汉族人与塔吉克族人比较差异无统计学意义（基因型：χ2＝2.90，P＝0.235等位基因：χ2＝2.996，P＝0.083）。朝鲜族与塔吉克族人比较差异无统计学意义（基因型：χ2＝0.893，P＝0.640等位基因：χ2＝0.804，P＝0.370）。

表2 不同地区（不同民族）人群LPL HindⅢ位点基因型和等位基因频率

2.4 不同种族之间健康人群LPL基因HindⅢ位点基因频率比较

由表3可知：本文研究与法国，英国，印度等人群相关资料比较发现，不同种族间以基因型和等位基因频率均存在极显著差异（P＜0.01）［10－13］。而与美国［9］，韩国人［14］比较均有显著性差异（P＜0.05）。而与丹麦［7］，日本人［8］比较均无显著性差异（P＞0.05）。

表3 不同种族健康人群中LPL HindⅢ位点基因型和等位基因频率分布的比较

3 讨论

随着分子生物学和分子遗传学研究的不断深入人们已经认识到基因的多态性可以造成某些疾病不同的易感性，对于人类基因多态性的研究可以了解各种基因的不同基因型在人群中的分布，有助于我们从基因水平更深刻的阐明各种疾病在不同种族，不同人群中存在不同发病率和不同临床特点的内在机制。LPL是脂质代谢中的关键酶，在富含TG精蛋白代谢过程中起主要作用。其基因具有易突变性和明显的多态性，多态性变异可能会影响LPL的含量及活性，从而影响TG代谢和血浆脂蛋白的水平［15］。HindⅢ位点在LPL基因的变异位点中比较常见，是由一个T→G碱基置换引起HindⅢ酶切位点缺失导致的多态性，有酶切位点定为 H＋，无HindⅢ 酶切位点定为 H－，产生3种基因型 H＋H＋、H＋H－、H－H－［16］。关于LPL过去几十年的研究提高了我们对LPL结构与功能、突变与疾病的认识。LPL基因突变与糖尿病、高血压、肥胖、动脉硬化等都有一定的相关性。因此，基因多态性的研究是解释多种疾病临床表现多样化的一个有力工具。而在对一些致病基因的多态性分布进行研究时，首先了解其在正常人群中的分布特点是正确分析基因多态性与疾病之间关系的前提条件。

本研究应用PCR－RFLP方法分析了新疆地区91例健康塔吉克族人群LPL基因HindⅢ位点基因多态性的遗传分析，并将美国［9］，法国［10］，英国［11，12］，韩国［14］，印度［13］等人群基因多态性研究结果与本研究比较发现，基因型和等位基因频率均存在显著差异（P＜0.01，P＜0.05），而与吉林［16］，广西地区人群［17］基因型分布相似（P＞0.05），以上结果符合遗传学规律，即亲缘关系越远，其基因型分布越显著，这可能种族和地域的差别所致。因此我们认为造成这种差异不仅是由于不同种族之间生活环境和生活习惯的不同所致，不同的基因背景也是其中不可忽视的一个重要原因。

总之，了解我国塔吉克族人群中该基因遗传多态性的分布特点对认识一些疾病在不同种族间表现出来的差异具有重要意义，也为进一步的群体遗传学的研究和基因多态性普查奠定了基础，并为进行疾病前瞻性研究提供了重要的基础资料。

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