抗原负载的DC及CIK对结肠癌细胞SW1116杀伤活性的比较研究

王 斌，刘玉侠，何春莹，陈佳祺

（1.吉林省肿瘤医院 腹外科，吉林 长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所，吉林 长春130012）

肿瘤的治疗除了传统的手术、化疗、放疗外，近年来生物治疗在肿瘤的治疗中发挥着重要作用。由于生物治疗对人体没有毒副作用，对肿瘤的转移和复发具有预防和治疗作用，所以近年来在肿瘤治疗领域得到了较广泛的重视。本实验通过体外培养DC，CIK细胞并与人结肠癌细胞SW1116共同培养，检测两种细胞对结肠癌细胞SW1116的体外杀伤效果，为结肠癌的生物治疗提供实验数据以及理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料 淋巴细胞分离液（比重1.078）：中国医学科学院血研所科技公司；GM－CSF，TNF－α，IL－4，IL－1α：Peprotech 公司；IMDM培养基：GIBCO 公司；CD3单抗：RD公司；IL－2：北京四环生物公司；IFN－γ，上海凯茂生物医药有限公司；胎牛血清：天津TBD生物技术发展中心；MTT：Sigma公司。

1.2 结肠癌细胞株SW1116 购于中国科学院上海生命科学研究院

1.3 方法

1.3.1 DC的诱导、培养、鉴定 参见文献［1］。

1.3.2 CIK的诱导、培养 首先用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞，计数细胞数为1×106／ml，加入细胞培养瓶，放入37℃，5%CO2培养箱培养，然后将培养的外周血单核细胞加入IFN－r 1 000U／ml，CD3Ab 100ng／ml，IL－1a1000U／ml，IL－2 1000 U／ml，每3天换液，同时补加IL－2。

1.3.3 CIK细胞表型的测定 将诱导培养的CIK细胞用FITC标记的CD3Ab、PE标记的CD16、CD56Ab标记CIK细胞，用流式细胞仪检测CD3＋CD16＋CD56＋细胞的表达。

1.3.4 培养结肠癌细胞SW1116 将SW1116用含10%IMDM的培养基培养至对数生长期，用0.25%胰酶消化后离心洗涤，调细胞数为5×104／ml，接种到96孔细胞培养板。

1.3.5 SW1116抗原的提取方法 参见文献［1］。

1.3.6 负载抗原的 DC（DCAg），CIK 对结肠癌细胞SW1116杀伤活性测定 将培养的DCAg，CIK调细胞数为2.5×106／ml，按以下设计加入到已接种SW1116的细胞培养板内，每组设6复孔。

第1组 DCAg，第2组 CIK，第3组 DCAg＋SW1116，第4组CIK＋SW1116，第5组SW1116。将以上加入细胞的培养板放入37℃，5%CO2培养箱培养24小时。培养结束前4小时加入MTT，培养结束，吸去上清，加150μl DMSO，振荡混匀，用酶标仪在292nm处测OD值。

1.4 统计学处理

应用SPSS V16.0软件，采用t检验对数据进行处理。

2 结果

2.1 CIK细胞表型测定结果 见图1。从图中可以看出CD3＋CD16＋CD56＋表达为74.3%，证明CIK的比例很高。

图1 CIK细胞表型测定

2.2 DCAg，CIK对SW1116细胞杀伤活性，见表1。

表1 DCAg，CIK细胞对SW1116细胞杀伤活性

从以上结果可以看出，负载抗原的DC和CIK对SW1116均有较强的杀伤效果，两者之间在统计学上没有差别。

3 讨论

结肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，它严重威胁着人类的健康。世界范围内结肠癌的发病率占所有恶性肿瘤的第3位，每年约有120万例新增患者，其中40%－50%的患者发现时已有转移［2］，近80%的患者就诊时已属于晚期。病变发现早期进行手术，患者5年生存率可以达到90%，而发生转移的结肠癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者5年生存率仅为10%［3］。结直肠癌引起的死亡也是全世界恶性肿瘤导致死亡的主要原因之一，目前，结肠癌在我国发病率呈现上升趋势［4］，而其常规的治疗手段包括手术、化疗、放疗，这些方法虽然对结肠癌的治疗起到很好效果，但是对一些微小转移灶还不能达到彻底根除的目的。生物治疗是近年来发展起来的有效治疗肿瘤的一种方法，它对肿瘤的直接杀伤作用以及通过活化机体免疫功能主动攻击肿瘤作用，使其对肿瘤治疗效果的提高发挥了独特的效果，已成为肿瘤治疗的又一种有效治疗方法。

生物治疗细胞有很多种，本实验选择了DC和CIK针对结肠癌进行体外实验，以证明它们的抗结肠癌效果，为临床应用提供实验数据。

DC是人体内功能最强的，唯一能激活初始型T淋巴细胞的抗原递呈细胞［5］，它能够摄取、加工、递呈抗原［6］，促进CTL细胞和Th细胞的生成，启动T细胞介导的免疫反应，发挥抗肿瘤作用。

CIK细胞又被称为NK细胞样T淋巴细胞，它同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，所以兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。

本实验通过负载抗原的DC和CIK对结肠癌细胞SW1116的体外杀伤实验结果证明，DC和CIK对SW1116均具有较强的抗肿瘤活性，对其杀伤率分别达到64.10%和67.70%。根据它们不同的抗肿瘤特性，在临床应用时可以选择联合应用，以达到最佳的抗肿瘤效果。

［1］刘玉侠，于 鸿，张振武，等.热休克蛋白70激发树突状细胞抗肝癌作用的实验研究［J］.中国实验诊断学，2010，14（12）：1969.

［2］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global Cancer Statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69.

［3］Meyerhardt JA，Mayer RJ.Systemic therapy for colorectal cancer［J］.N Engl J Med，2005，352（5）：476.

［4］于世英.临床肿瘤学［M］.北京：科学出版社，2006：197.

［5］Nair SK，Synder D，Rous BT，et al.Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen－pregenting cells pulsed with tumor extracts［J］.Int J Cancer，1997，70：706.

［6］Gilboa E.DC－based cancer vaccines［J］.J Chin Invest，2007，117：1195.