恩诺沙星与其他抗菌药对鸡毒支原体的体外联合抑菌试验

刘轶秋，张 媛，薛青红，徐 磊，张瑞婷，蒋玉文

(中国兽医药品监察所，北京100081)

禽类支原体(Avian Mycoplasma)及其引起的疾病已引起国内外的广泛重视。从Nelson于1935年首先从患有感冒的鸡中分离到支原体至今，已从家禽体内分离鉴定出19种支原体。这些支原体中，大多数对动物不致病，对家禽引起危害的主要有鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum，MG)、滑液支原体、衣阿华支原体和火鸡支原体。其中鸡毒支原体是禽类最主要的病原菌之一，它可以引起鸡、火鸡及其它禽类的慢性呼吸道病(chromic respiratory disease，CRD)。该病最大特点是:发病率高，病程长，康复慢。鸡毒支原体病目前在我国的发生和流行呈上升趋势，几乎100%的鸡场都有此病，鸡群最高感染率可达83.4%，且经常与其他病原菌混合感染，引起一些疫病的暴发和流行，对养禽业危害很大。所以对该病的防治，除使用疫苗进行预防外，药物控制依然是治疗该病的有效手段。通过试验摸索鸡毒支原体的敏感药物及如何联合用药对临床治疗鸡毒支原体病具有一定的指导意义。临床上治疗CRD常用大环内酯类、四环素类、林可胺类和氟喹诺酮类[1]等药物。恩诺沙星是动物专用的氟喹诺酮类药物，属于一类广谱抗菌剂，由于其优良的抗菌活性、良好的安全性而受到世界广泛的关注[2]。恩诺沙星无论在试管中还是在鸡体内，对鸡毒支原体都有强大的抑菌作用，是治疗鸡毒支原体病的理想药物[3]。

试验选取恩诺沙星、替米考星、泰乐菌素、吉他霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、氯霉素及氟苯尼考，对鸡毒支原体BG44T株进行体外抑菌试验，确定药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，摸索其药物敏感性并通过恩诺沙星与其他抗菌药的联合药敏试验，找到与其协同或相加的抗菌药，为防治鸡毒支原体病提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 药品 恩诺沙星对照品，含量99.9%，批号H0081206;替米考星对照品，含量93.7%，批号K0311109;泰乐菌素标准品，每1 mg相当于泰乐菌素1026单位，批号K0160911;吉他霉素标准品，每1 mg相当于吉他霉素1611单位，批号K0151010;林可霉素对照品，含量84.9%，批号K0101003;延胡索酸泰妙菌素对照品，含量99.7%，批号K0340808;氯霉素对照品:含量为99.5%，批号:K0350706;氟苯尼考对照品:含量为99.3% ，批号:K0301004，均由中国兽医药品监察所提供。沃尼妙林，含量98.5%，批号100102，由浙江海正药业股份有限公司提供。分别称取各药并溶于适宜溶剂中，无菌操作配制成1280 μg/mL，于4℃保存备用。

1.2 支原体培养 基改良Frey氏液体培养基，参照现行《中华人民共和国兽药典》二〇一〇年版三部[4]上规定方法配制。

1.3 菌种及菌液制备 鸡毒支原体BG44T(CVCC350)株，由中国兽医药品监察所提供。取菌种，通过复壮并培养，使颜色变化单位(color change unit，CCU)达到10-8CCU/mL以上，于-20℃保存备用。

1.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用试管二倍稀释法进行测定[5]。每排取无菌带胶塞试管10支，将改良Frey氏液体培养基分装于各管中，每管0.5 mL，取适宜浓度药液0.5 mL加入第1管充分混合后，取0.5 mL加入第2管，依此方法，进行稀释，至最后一管。取CCU达10-8CCU/mL的菌液，用改良Frey氏液体培养基稀释成10-4，于各管中加入0.5 mL。同时试验设2种对照:培养物对照——接种菌液，不加抗菌药;培养基对照——不接种菌液，不加抗菌药。每次试验重复3次。所有试验管放置于37℃温箱中培养，当培养物对照为橘黄色，对照培养基不发生颜色变化时，未发生颜色变化的最低药物浓度为该药物的MIC值。

1.5 体外联合抑菌试验 参照戴自英[5]等的棋盘法进行试验。根据已测得的MIC值，以两药MIC值的4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍分别联合。联合药敏的相互作用以FIC指数作为判定标准。

FIC=甲药联合时的MIC/甲药单用时的MIC+乙药联合时的MIC/乙药单用时的MIC。判定标准:FIC≤0.5为协同作用;0.5＜FIC≤1为相加作用;1＜FIC≤2为无关作用;FIC＞2为拮抗作用。

2 结果

2.1 恩诺沙星、替米考星、泰乐菌素、吉他霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、氯霉素、氟苯尼考对鸡毒支原体BG44T株的MIC 试验测定的MIC结果表明，MG BG44T株对恩诺沙星、替米考星、泰乐菌素、吉他霉素、沃尼妙林、泰妙菌素均敏感(表1)。

2.2 恩诺沙星与其他抗菌药合用对鸡毒支原体BG44T株的联合药敏作用 恩诺沙星分别与替米考星、泰乐菌素、吉他霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素联合，FIC指数在0.63～1之间，显示这6组抗菌药物联用对MG表现为相加作用;恩诺沙星与氯霉素、氟苯尼考联用对MG表现为拮抗作用(表2-表3)。

表1 9种抗菌药对鸡毒支原体BG44T株的MIC μg/mL

表2 恩诺沙星与其他抗菌药合用对鸡毒支原体BG44T株的联合药敏结果 μg/mL

表3 恩诺沙星与其他抗菌药合用对鸡毒支原体BG44T株的联合药敏作用

3 讨论

3.1 MGBG44T株对抗菌药的敏感性 国内外关于用抗生素测定鸡毒支原体MIC的报道比较有限。仅有曾振灵[6]用恩诺沙星测定MG BG44T株MIC(0.025 μg/mL)的报道，与本试验所测 BG44T株MIC值(0.063 μg/mL)比较，两值相差不大。曾振灵[6]用泰乐菌素测定 MG BG44T株 MIC值(0.00625 μg/mL)与本试验所测定的 MIC值(0.016 μg/mL);李宏胜[7]用替米考星测定 MGBG44T株MIC值(＜0.0156 μg/mL)与本试验所测MIC值(0.004 μg/mL)，由这两组试验数据可以看出，虽然不同试验者所测的数据有一定差异，但依然可以说明BG44T株对泰乐菌素、替米考星均敏感，适合临床用药。在实际临床用药报道中，应用恩诺沙星[8]、泰乐菌素[9]、替米考星[10]治疗鸡毒支原体病均获得较高治愈率，也直接验证了这些药的疗效。未见用吉他霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、林可霉素、氯霉素、氟苯尼考测定MG BG44T株MIC的报道。但在对鸡毒支原体其他菌株，如S6株、PG31株、F株和R株MIC测定的报道中，发现这些菌株均对恩诺沙星、泰乐菌素、泰妙菌素、林可霉素、替米考星、氟苯尼考敏感，而本试验中BG44T株只对恩诺沙星、泰乐菌素、泰妙菌素、替米考星敏感，说明鸡毒支原体不同菌株对某些抗生素的敏感性存在差异。

3.2 几种抗菌药联合应用对MGBG44T株的体外抑菌作用 王春华等[11]联合恩诺沙星与替米考星治疗鸡毒支原体病，显示效果显著。有文献报道氟喹诺酮类和林可霉素联用可用于治疗鸡支原体合并大肠杆菌感染[12]。本试验通过对MGBG44T株的联合药敏试验，从理论上验证了恩诺沙星+替米考星、恩诺沙星+林可霉素的联合作用，说明可用于治疗鸡毒支原体病。未见恩诺沙星与其他4种药临床应用效果的报道，但从试验数据显示，因表现为相加作用，故为能更加有效的防治支原体与其他病原菌的混合感染，临床上可考虑联合应用。恩诺沙星-氯霉素联合、恩诺沙星-氟苯尼考联合，FIC指数均为2.5，表现为拮抗作用，提示在临床应用上应避免同时使用这两种药，以免失去药效。有报道指出氟喹诺酮类抗菌药物不能与氯霉素等合用，因合用后可导致效用降低，同时会影响肝肾功能及神经系统[13]。刘瑞安[14]也指出喹诺酮类药物与氯霉素类联用可能会出现无关或拮抗作用，所以在临床使用中应避免此种方式联合。但陈忠良[15]却提出了另一种用药方式可避免此种联合的拮抗作用，他指出对于先使用过氯霉素的畜禽，需过48h后再用恩诺沙星，可避免减效。

3.3 应用抗生素治疗仍是防治鸡毒支原体病的主要手段 鸡毒支原体是引起鸡呼吸道病的主要病原微生物，感染后可造成鸡肉品质下降，鸡群产蛋量减少，经济损失明显。因鸡毒支原体常与多种细菌、病毒混合造成感染，且MG不同菌株对抗生素敏感性和抗药性存在差异，为保证药物疗效，防止和减缓耐药菌株的形成，临床上多采用药物联合或交替使用的方式[16]。目前对鸡毒支原体病的防治，虽然更多的是先进行体外抑菌试验，根据试验结果指导临床用药，但药物联合作用于机体后，对机体及生产性能产生何种影响，是否有不良反应等，这些更需要研究人员密切关注，进一步研究确证。

研究通过几种抗菌药物对MGBG44T株的体外抑菌试验，初步了解了恩诺沙星与某些药物联用的作用，为鸡毒支原体病的防治提供了一些参考。但要真正了解鸡毒支原体对哪些药物敏感及如何联合用药，还需要进行更深入的研究，以期对鸡毒支原体病的防治更加科学、合理。

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