共表达PRRSV GP5和N蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

杨 雷，漆世华，温文生，李玉萍，王焕君，谢红玲

(武汉中博生物股份有限公司，武汉430070)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)主要引起妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病及免疫抑制和持续性感染，死亡率不断升高[1-2]。1996年郭宝清等[3]首次从国内疑似猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)感染猪群中分离出PRRSV，从而证实了本病在我国的存在。PRRSV是动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的单股正链RNA病毒。其全基因组长约15 kb，含有9个开放阅读框(ORFs)，0RFla和0RFlb编码蛋白聚合酶，ORF 2～7分别编码结构蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M 和 N 蛋白[4]。其中，N蛋白也称核衣壳蛋白，由0RF7编码，在病毒粒子中含量较高，N基因高度保守。N蛋白约15 kD，至少有5个抗原决定簇，其中包括两型的共同决定簇和特异性决定簇，具有一个糖基化位点，但它不是?糖基化蛋白。N蛋白的C端在维持蛋白构象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys、His 3中碱性氨基酸组成，可能和RNA基因组间的相互作用有关。N蛋白之间形成同源二聚体，对病毒的组装至关重要，可以诱导机体产生细胞免疫作用[5]。GP5蛋白约25 kD，由0RF5编码，是一个糖基化蛋白，含有4个糖基化位点，且非常不保守，三次跨膜，并有一个70个氨基酸残基的胞外区。有6个抗原决定簇，有证据表明GP5在PRRSV的抗体识别过程中起关键作用，是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性，同时 GP5还可诱导细胞凋亡，是公认的PRRSV的主要保护性抗原[6]。

目前用于预防PRRS的疫苗主要是传统疫苗——弱毒苗和灭活苗。尽管弱毒疫苗能够提供较好的免疫保护，但存在毒力返强和散毒的危险[7]。而灭活疫苗诱导产生的抗体水平很低，且极不稳定。因此，研发确实、可靠、高效的新一代疫苗也是未来一个方向。本研究利用杆状病毒双表达载体(pFastBacTMDual)同时表达HP-PRRSV GP5蛋白和N蛋白，以期更好的发挥PRRSV GP5、N抗原活性及协同作用，为PRRSV基因工程疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体、细胞、菌株与病毒 杆状病毒载体pFastBacTMDual、昆虫 Sf9 细胞、E．coli DH10Bac购于美国Invitrogen公司。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒广东分离株(PRRSV GD)由中国兽医药品监察所提供。

1.2 主要试剂 限制性内切酶、PCR相关试剂为TaKaRa公司产品;Cellfectin®ⅡReagent为Invitrogen公司产品;抗PRRSV N蛋白的鼠单克隆抗体为美国VMRD公司，Prod:P080728-004;抗PRRSV GP5蛋白的兔多抗为英国ABCAM公司，Prod:RS-4504R;PRRSV GP5抗体检测试剂盒为法国LSI公司，Batch:5-VRTPRA-028;PRRSV N抗体检测试剂盒为美国IDEXX公司，Prod:Z411。

1.3 引物设计和PCR扩增 参照PRRSV GD株(GenBank登录号:EU109503.1)ORF7和ORF5基因的序列，各设计一对针对PRRSV GD毒株N和GP5蛋白基因的特异性引物，扩增N蛋白基因带BamHⅠ酶切位点的上游引物 NF:5’-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’和带 HindⅢ酶切位点的下游引物 NR:5’-AAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’;扩增 GP5蛋白基因带XhoⅠ酶切位点的上游引物GP5F:5’-CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’和带 KpnⅠ酶切位点的下游引物 GP5R:5’-GGTACCCTAGAGACGACCCCATCGTTC-3’，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

按照TakaR RNA试剂盒说明书提取PRRSV GD株RNA，以oligo(dT)为引物，以M-MLV进行反转录;然后以cDNA产物为模板，应用PCR技术扩增出PRRSV GD毒株的N和GP5全基因;N和GP5基因的扩增条件均为:94℃ 5 min;94℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72℃ 45 s，35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。

1.4 重组杆状Bac-N-GP5病毒的制备 将PCR扩增的N蛋白基因和GP5蛋白基因通过酶切及酶连接的方式插入杆状病毒载体pFBD(pFast-BacTMDual的缩写)中，获得含有 N蛋白基因和GP5蛋白基因的重组杆状病毒载体pFBD-NGP5。N蛋白基因通过polyhedrin启动子调控，GP5基因由p10启动子直接调控，其构建示意图见图1。

按照Invitrogen说明书将上述重组载体pFBDN-GP5通过 Bac-to-Bac系统(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)转入 DH10Bac E．coli，进行菌内同源重组。用卡那霉素、庆大霉素和四环素筛选获得重组病毒DNA，PCR鉴定，然后将正确的重组病毒DNA用Cellfectin®ⅡReagent传染SF9细胞，培养3～4 d，获得重组的杆状病毒Bac-N-GP5。

图1 重组质粒构建示意图

1.5 IFA检测重组杆状病毒Bac-N-GP5的表达

重组杆状病毒Bac-N-GP5接种Sf9细胞72 h后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次，80%(V/V)冷丙酮固定细胞 20 min，PBS洗三次，加鼠抗PRRSV N/兔抗PRRSV GP5抗体 (1∶100)37℃作用1 h，PBS洗三次，FITC标记羊抗鼠二抗/羊抗兔二抗(1∶500)37 ℃作用1 h，PBS 洗三次，50%(V/V)甘油封片，荧光显微镜观察。

1.6 Western blot检测 将感染重组杆状病毒的细胞裂解液通过12%SDS-PAGE电泳分离蛋白，采用半干转移(Bio-Rad)转印硝酸纤维膜，并设细胞裂解液作为空白对照。用含5%脱脂乳的PBST封闭过夜，分别以 N和 GP5蛋白的抗体为一抗，1∶1000稀释，室温孵育1 h;辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG和羊抗兔IgG为二抗，1∶1000稀释，室温孵肓1 h。用DAB显色液进行显色作用。

1.7 重组杆状病毒在小鼠中的免疫原性测定 用感染重组杆状病毒的细胞裂解液以铝佐剂为佐剂，于0和14 d免疫小鼠，于免疫后7、14、21、28 d采集小鼠血清，用ELISA测定抗N蛋白和抗GP5蛋白的抗体水平。

2 结果与分析

2.1 重组杆状病毒Bac-N-GP5的构建与鉴定

通过RT-PCR扩增得到了ORF7和ORF5基因，将其克隆入杆状病毒表达载体pFBD中，获得重组质粒pFBD-N-GP5。经PCR鉴定表明基因N和GP5克隆到杆状病毒表达载体pFBD中(图2)，测序表明该重组质粒的读码框正确。

图2 PCR检测重组质粒pFBD-N-GP5

2.2 IFA鉴定重组杆状病毒的表达 用针对PRRSVN和GP5蛋白的抗体进行IFA试验，结果发现重组杆状病毒感染的细胞出现明显的荧光，而对照组则看不到荧光(图3)。证明N蛋白和GP5蛋白可以在重组杆状病毒中共同表达。

2.3 重组杆状病毒Western blot分析 重组杆状病毒感染Sf9细胞后经Western blot检测，结果见图4。抗N蛋白抗体和抗GP5蛋白的抗体分别检测到约为15 kD的N蛋白和25 kD的GP5蛋白条带。证实N和GP5重组蛋白在Sf9细胞中表达成功。

2.4 重组杆状病毒在小鼠中的免疫原性测定 用感染重组杆状病毒的细胞裂解液以铝佐剂为佐剂，于0和14 d免疫小鼠，于免疫后7、14、21、28 d采集小鼠血清，分别用抗PRRSV N蛋白和GP5蛋白的抗体ELISA检测试剂盒对免疫后的血清中的N蛋白产生的抗体和GP5蛋白产生的抗体进行测定，结果表明免疫组血清抗N蛋白和抗GP5蛋白的抗体在14 d开始升高，21和28 d的抗体值明显高于对照组(图5、图6)，说明重组杆状病毒表达的N和GP5蛋白对小鼠能够产生很好免疫原性。关于重组杆状病毒对本属动物猪的免疫和攻毒保护效果还有待于进一步研究。

图3 重组杆状病毒表达N和GP5蛋白的间接免疫荧光检测

3 讨论

目前PRRS的防治主要依靠传统疫苗，即弱毒疫苗和灭活苗，但由于这些疫苗均存在不同程度的缺陷，主要是免疫效果不理想。此外，活疫苗还存在毒力返强和散毒的危险等。因此国内外许多研究者都在努力探索各种形式的基因工程疫苗，使用不同的表达系统来表达主要免疫原PRRSV中的GP5、N和M蛋白基因及一些细胞因子。其中杆状病毒一昆虫细胞表达系统是目前较好的真核表达系统，此系统能够提高外源蛋白产量，并且表达的蛋白能够经过正确的翻译后修饰加工，更接近天然蛋白的构象和活性，因此该系统被应用于很多外源蛋白的表达。

本试验将PRRSV的ORF7基因和ORF5基因分别插入到polyhedrin启动子和p10启动子下，构建重组杆状病毒。结果表明，用重组病毒Bac-N-GP5感染Sf9细胞后，经IFA和Western blot检测，能够在细胞中检测到N和GP5蛋白的共表达。动物免疫试验表明，重组杆状病毒免疫小鼠后血清中N和GP5蛋白的抗体水平明显高于对照组，说明重组蛋白能够引发小鼠较强的体液免疫反应。本试验利用杆状病毒双表达系统同时在Sf9细胞中表达PRRSV N蛋白和GP5蛋白，为下一步应用重组杆状病毒作为PRRSV亚单位疫苗奠定了基础。

[1]Chung W B，Lin M W，Chang W F，et al.Persistence of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Intensive Farrow-to-Finish Pig Herds[J].Can J Vet Res，1997，61(4):292-298.

[2]Van G S，Van R K，Pensaert M.Interaction between Porcine Reproductive Respiratory syndrome Virus and Bacterial Endotoxin in the Lungs of Pigs:Potentiation of Cytokine Production and Respiratory Disease[J].J Clin Microbiol，2003，4l(3):960-966.

[3]郭宝清，陈章水，刘文兴，等.从疑似PRRS流产胎儿分离猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的研究[J].中国畜禽传染病，1996，87(2):1-5.

[4]Nelsen C J，Murtaugh M P，Faaberg K S.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison:divergent evolution on two continents[J].J Virol，1999，73(1):270-280.

[5]Nelson E A，Christopher-Hennings J，Drew T，et al.Differentiation of U.S.and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies[J].J Clin Microbiol，1993，31:3184-3189.

[6]Zhou Y J，Yu H，Tian Z J，et al.Monoclonal antibodies and conserved antigenic epitopes in the C terminus GP5 protein of the North American type porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Microbiol，2009，138:1-10.

[7]Madsen K G，Hansen C M，Madsen E S，et al.Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the American type collected from Danish swine herds[J].Arch Virol，1998，143(9):1683-1700.