二种牛型提纯结核菌素变态反应试验结果比较

卫龙兴，王国贤，盛岳山，戴连群* ，洪云超，韩岳荣

(1.上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海201400;2.上海市奉贤区庄行镇畜牧兽医站，上海201415;3.上海市奉贤区奉城镇畜牧兽医站，上海201411)

结核病曾经是人类历史上最猖獗的传染病之一，它是一种由结核分枝杆菌引起的、人和多种动物共患的、古老而复杂的慢性传染病。抗结核药物的出现，才使这一疾病有所缓解，但由于结核病的生理特性和复杂的社会因素，加之近年来各国对结核病的忽视，使结核病重新成为了全球性的的人类健康问题，全球每年因结核病死亡的人数达200余万人，而发病数更是超过了800万人[1-2]，成为了世界范围内的头号杀手。我国是结核病严重流行的国家，其发病率和死亡率均仅次于印度而居世界第二位，结核病也因此成为了我国重点防控的传染病之一。结核病牛是人类结核病的主要传染源，但对于结核病牛的检测方法，目前世界上普遍采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的提纯结核菌素(PPD)皮内变态反应试验(简称PPD试验)[3]，我国也不例外。但采用这一方法检测结核病牛易受到PPD非特异性反应的干扰而造成误判。为了解和分析国内外不同厂家生产的牛型PPD的反应性，试验选择了国产和荷兰产二种牛型PPD，对辖区内两家不同规模奶牛场的100头青年奶牛进行了一次皮内变态反应试验的结果比较。

1 材料与方法

1.1 参试牛只 随机选取某存栏奶牛2000头以上大型奶牛场12～18月龄青年母牛85头和某存栏奶牛200头左右小型奶牛场12～18月龄青年母牛15头，共100头青年母牛。

1.2 参试PPD 国产牛型提纯结核菌素(简称国产PPD)，哈药集团生物疫苗有限公司，批号:201003，使用前用灭菌注射用水稀释成每mL含PPD 20000 IU。荷兰产牛型提纯结核菌素(简称荷兰产PPD)，荷兰Prionics公司，批号:102115，每mL含PPD 30000 IU。

1.3 方法

1.3.1 牛只处理 对所有参试牛只按照(《动物结核病诊断技术》GB/T18645-2002)PPD皮内变态反应试验的要求，在每头牛左右两侧的颈中部上三分之一处进行剪毛(面积大于10 cm×10 cm)、量取原皮厚、作好记录、局部消毒。采用英国进口全金属自动进量连续皮内注射器，分别在每头参试牛的左侧颈部剪毛消毒处皮内注射国产PPD 0.1 mL(2000 IU)、在右侧颈部剪毛消毒处皮内注射荷兰产PPD 0.1 mL(3000 IU)，并确认注射有效。

1.3.2 试验判定 72 h后观察反应，测量每个试验点的皮厚，每头牛对应作好记录，并计算与原皮的皮厚差。国产和荷兰产二种牛型PPD均按照(《动物结核病诊断技术》GB/T18645-2002)牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验的标准进行判定[3]。

阳性反应:局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0 mm者，判为阳性反应，记作(+)。疑似反应:局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0 mm、小于4.0 mm者，判为可疑，记作(±)。阴性反应:无炎性反应，皮厚差在2.0 mm以下者，判为阴性，记作(-)。

1.3.3 细菌培养复核试验 对PPD试验判定结果为阳性的牛只，扑杀后采取肺门淋巴结样品送上海市疾病预防控制中心作结核杆菌细菌培养和分离鉴定[3]。

2 结果与分析

2.1 二种PPD试验结果(反应点)比较 二种牛型PPD各进行了100个皮内变态反应试验点，结果国产PPD有30个试验点、荷兰产PPD有20个试验点分别出现不同程度的变态反应。经综合判定后，共有10个试验点被判为(+)、40个试验点被判为(±)。综合判定结果见表1。

表1 国产和荷兰产PPD试验结果(反应点)比较 单位:头

分析表1发现:在皮内注射剂量荷兰产PPD＞国产PPD的情况下，10个(+)和40个(±)反应试验点，国产PPD与荷兰产PPD的(+)反应比例为7∶3，(±)反应比例为23∶17;从出现反应的试验点数量分析，国产PPD的皮内变态反应试验结果明显大于荷兰产PPD。

2.2 相同判定结果牛只不同PPD皮内变态反应结果的比较 对30个国产PPD和20个荷兰产PPD出现变态反应试验点的牛只，依据二种PPD的皮内变态反应判定结果进行比较(表2)。

表2 国产与荷兰产PPD判定结果(牛只)比较 单位:头

分析表2发现，二种PPD的50个反应点集中在36头试验牛，其中有9头牛国产PPD和荷兰产PPD的判定结果相符[2头(+)、7头(±)]，占出现反应牛只总数的25%。有20头牛国产PPD的判定结果＞荷兰产PPD，占出现反应牛只总数的55.6%;其中5头国产PPD判定结果为(+)的牛只，荷兰产PPD判定结果为4头(±)和1头(-);15头国产PPD判定结果为(±)的牛只，荷兰产PPD判定结果均为(-)。另有7头牛国产PPD的判定结果＜荷兰产PPD，占出现反应牛只总数的19.4%;其中1头国产PPD判定结果为(±)的牛只，荷兰产PPD判定结果为(+);6头国产PPD判定结果为(-)的牛只，荷兰产PPD判定结果为(±)。

结果显示:36头出现变态反应的试验牛中，除9头牛(25%)二种PPD的判定结果相符外，其余27头牛(75%)二种PPD的判定结果出现了不同程度的分离，而且国产PPD判定结果＞荷兰产PPD的牛只数显著大于荷兰产PPD判定结果＞国产PPD 的牛只数(20∶7)。

表3 二种PPD试验结果分离的牛只分类比较单位:头

对27头国产和荷兰产二种PPD试验结果出现分离牛只判定结果的分类比较见表3。结果显示:在国产PPD试验结果＞荷兰产PPD的5头(+)和15头(±)牛中，荷兰产PPD仅4头牛表现(±)，其余16头牛均为(-);而在荷兰产PPD试验结果＞国产 PPD的1头(+)和6头(±)牛中，国产PPD只有1头牛的试验结果为(±)，其他均为(-)。

综合表2和表3的比较结果，在国产PPD的使用剂量(2000 IU)小于荷兰产PPD(3000 IU)的情况下，国产PPD的皮内变态反应试验结果(牛头数)显著大于荷兰产PPD。

经采用统计学分析T检验的方法计算，国产和荷兰产二种PPD变态反应成对试验皮厚差之间的P值为0.00298，二种PPD试验结果差异极显著(P＜0.01)。

2.3 复核试验结果 采用结核杆菌细菌培养的方法对PPD皮内变态反应试验判定结果(+)牛只进行复核。经对8头PPD试验(+)牛只[2头二种PPD均为(+)、5头国产 PPD(+)、1头荷兰产PPD(+)]肺门淋巴结样品进行结核杆菌培养，结果全部为阴性[4-5]。结果提示PPD试验(+)结果可能为非特异性反应。

3 讨论与小结

由于试剂采购及试验方案设计等因素影响，试验过程未能采用PPD国际标准品或国家标准品与二种参试PPD的判定结果进行比较，但通过对二种参试PPD相关试验结果的系统分析与比较，结果显示国产PPD反应性显著大于荷兰产PPD，可能影响牛结核病检疫结果的判定，应在临床应用中注意复核。

PPD试验阳性样品结核杆菌细菌培养复核结果显示，二种PPD诊断液均存在较强的非特异性反应，而且虽然国产PPD诊断液的使用剂量较小，但反应结果却显著大于荷兰产PPD诊断液。综合试验结果证明:国产PPD诊断液的非特异性反应较强，应注重多种检测方法的综合判定。

[1]郭开彬.奶牛结核病流行病学调查研究[J].草业与畜牧.2008，12:39-43.

[2]全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25(1):3-7.

[3]毛开荣，陈向经，关孚时.动物结核病诊断技术(GB/T 18645-2002)[S].

[4]世界动物卫生组织.哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册[M].北京:中国农业出版社，2002:337-349.

[5]何昭阳，胡希荣，王振国.结核变态反应阳性牛的非典型性分枝杆菌的分离和鉴定[J].畜牧兽医学报 ，1994，25(3):247-251.