超高效液相色谱-串联质谱法检测猪尿中20种β-受体激动剂残留

李 丹，孙 雷，毕言锋，苏富琴，徐秉恩，王鹤佳，徐士新

(中国兽医药品监察所国家兽药残留基准实验室，北京100081)

β-受体激动剂(β-agonists)是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，在饲料中添加该类药物给动物饲喂后具有营养再分配作用，可以明显提高动物的瘦肉率，但是人们食用了这些药物残留的畜禽产品后会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应症状[1-2]，严重的可能危及生命。因此国际上很多国家先后立法禁止在畜禽生产上使用该类药物，我国政府也明令禁止其使用。目前，欧盟和我国都将猪尿、猪肝、牛羊肉等动物性食品中该类药物的检测判定限定为1 μg/L(μg/kg)。

多年来，我国农业部一直通过猪尿、猪肝和牛羊肉等样品对国内畜产品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等β-受体激动剂残留实施例行监测和残留监控，以确保我国动物性食品质量安全。其中，猪尿样品相对于猪肝等动物组织样品，具有宰前检测、样品处理简单等优点。近年来，随着串联四极杆质谱和高分辨质谱的广泛应用，人们不断发现氯丙那林、齐帕特罗和其它种类的β-受体激动剂在养殖等环节非法添加使用，因此农业部2010年1519号公告又禁止在饲料和动物饮水中使用氯丙那林、齐帕特罗一系列新型的β-受体激动剂，但农业部现行的1025号公告-11-2008和1063公告-3-2008仅能对动物尿液中4种和11种β-受体激动剂进行检测，给违禁使用新型β-受体激动剂的查处造成不便。本研究旨在研发一种能快速且准确地定性定量检测猪尿中20种β-受体激动剂残留的UPLC-MS/MS检测方法，为行政主管部门对市场上已经出现和可能出现的其他种类新型的β-受体激动剂进行有效监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器 Acquity UPLC-Quattro premier XETM质谱联用仪(Waters公司);DKZ-2型电热恒温振荡水槽(上海精宏实验设备公司);Delta 320 pH计(Mettler Toledo公司);Biofuge Strators高速冷冻离心机(贺利氏公司);Organomation Associates氮吹仪(Jnc公司);SIR4漩涡混合器(IKA公司)。

1.2 试剂和材料 吡布特罗、西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克仑特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦异磅特罗、克伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗、马喷特罗，西马特罗-D7，沙丁胺醇-D3，莱克多巴胺-D3，克仑特罗 -D9，班布特罗 -D9，克伦潘特 -D5，克伦丙罗-D7，溴布特罗-D9纯度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(Merck公司);乙腈、甲酸为色谱纯(Fisher公司);氢氧化钠、乙酸铵、叔丁醇、叔丁基甲醚均为分析纯;所用水为超纯水;MCX固相萃取柱(60 mg/3 cc，waters公司)

1.3 对照溶液配制 精密称定适量的吡布特罗、西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克仑特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦异磅特罗、克伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗和马喷特罗对照品，用甲醇配制成1 mg/mL的各标准储备液。准确吸取0.1 mL的各标准储备液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10 μg/mL的混合标准工作液。

精密称定适量的西马特罗-D7，沙丁胺醇-D3，莱克多巴胺 -D3，克伦特罗 -D9，班布特罗 -D9，克伦潘特 -D5，克伦丙罗 -D7和溴布特罗 -D9，用甲醇配制成1 mg/mL的各内标储备液。准确吸取0.1 mL的各内标储备液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10 μg/mL的混合内标工作液。

1.4 样品前处理 准确吸取猪尿2 mL于50 mL离心管内，加入8种内标工作液适量，再加入0.2 mol/L乙酸铵缓冲液(pH=5.2)5 mL，β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50 μL，涡旋混匀，37℃下避光水浴振荡16 h。酶解后放置至室温，用10 mol/L NaOH溶液调pH至10±0.2，加入叔丁醇和叔丁基甲醚(6+4，V/V)15 mL，中速水平振荡10 min，5000 r/min离心5 min，将上层有机相转移至另一离心管内，50℃下氮气吹至体积小于1 mL，用2%甲酸溶液5 mL充分涡旋溶解，然后过经甲醇和2%甲酸溶液活化好的MCX固相萃取柱，再用2%甲酸溶液和甲醇溶液淋洗，用4%氨水甲醇溶液3 mL洗脱，洗脱液于50℃下氮气吹干，残余物用10%甲醇溶液0.5 mL溶解，过0.22 μm微孔滤膜，供UPLC-MS/MS测定。

1.5 仪器分析条件 色谱柱为BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7μm);流动相A相为0.1%甲酸乙腈溶液，B相为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱:0～1min，维持8%A;1～9 min，8%A线性变化至40%A;9～10 min，维持 8%A;流速为 0.3 mL/min;柱温为30 ℃;进样量为10 μL。

电喷雾离子源(ESI+);毛细管电压为3.2 kV;源温为110℃;脱溶剂温度为350℃;脱溶剂气速为650 L/Hr;锥孔反吹气速为50 L/Hr。多反应监测离子情况见表1。

表1 20种β-受体激动剂及内标监测离子对、对应的锥孔电压和碰撞能量

2 结果

2.1 标准曲线与线性范围 准确量取适量的西马特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、克伦特罗、班布特罗、克伦潘特、克伦丙罗和溴布特罗8种混合标准工作液和内标工作液，制得浓度为2、5、10、20、50 μg/L 的系列标准工作溶液(内标浓度为10 μg/L)，依次上机测定，以各药物定量离子质量色谱峰面积与对应的内标峰面积比值为纵坐标(y)，标液浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，得到线性方程(表2)。8种β-受体激动剂在2～50 μg/L的系列标液浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99。

其他12种β-受体激动剂取其混合标准工作液适量，分别添加到2 mL空白猪尿中，制得浓度为0.5、1.25、5、10、12.5 μg/L 的系列空白添加试料，按1.4项下所述方法进行处理，依次上机测定。以各药物定量离子质量色谱峰面积为纵坐标(y)，添加浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。可以看出12种β-受体激动剂在0.5～12.5 μg/L的系列空白添加浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99(表2)。

表2 20种β-受体激动剂标准曲线及相关系数

2.2 方法灵敏度 采用空白添加目标化合物的方法，依据特征离子质量色谱峰信噪比S/N＞3为方法检测限，S/N＞10为方法定量限，得出吡布特罗、西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克伦特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦异磅特罗、克伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗和马喷特罗等20种药物在猪尿中的定量限为0.5 μg/L，检测限为0.25 μg/L。

1 μg/L空白猪尿添加试液中20种β-受体激动剂特征离子质量色谱图见图1。

2.3 方法精密度与准确度 在空白猪尿中添加0.5、1、5 μg/L三个不同浓度的20种β-受体激动剂进行回收率试验，结果汇总见表3。可以看出，20种β-受体激动剂在空白组织中的平均添加回收率为75.7%～110.7%，批内批间相对标准偏差均小于20%。

3 讨论与小结

由于沙丁胺醇和莱克多巴胺等部分β-受体激动剂在动物体内代谢过程中，在葡萄糖醛酸转移酶、硫酸酯等作用下发生各种轭合反应，生成各种轭合物长期存在，因此在样品提取前要通过对应的酶类进行水解，使其结合态的待测物解离释放出来。有关酶解的条件、酶的品种、酶用量、酶解时间均有报道[3]，本方法采用了2 mL猪尿中添加50 μL β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，避光酶解16 h的方法进行。

表3 猪尿中20种β-受体激动剂添加回收率试验结果(n=5)

为了提取酸性水溶液中成盐的β-受体激动剂，先用浓氢氧化钠溶液调节pH至碱性，使药物呈游离状态，进而采用有机溶剂进行液液萃取，把猪尿中残留的20种β-受体激动剂尽可能地提取出来。针对20种β-受体激动剂，本方法通过参考相关文献，选择在pH=10条件下进行[4-5]。已报道的提取溶剂选择有乙酸乙酯、异丙醇、叔丁醇、氯仿、乙醚和叔丁基甲醚等不同溶剂系统组合及不同配比组合[6-7]，本方法为兼顾20种不同性质的β-受体激动剂，重点考察了乙酸乙酯+叔丁醇和叔丁醇+叔丁基甲醚两组溶剂系统及其不同配比的提取效果，最终选择了叔丁醇+叔丁基甲醚(6+4，V/V)从水相中萃取20种β-受体激动剂的方法，获得了满意的结果。

本方法通过对样品前处理条件的充分优化改进，建立了猪尿中20种β-受体激动剂残留检测的UPLC-MS/MS方法，其灵敏度、精确度均能满足兽药残留分析方法的要求，同时也为我国市场上已经出现和可能出现的其他种类新型的β-受体激动剂实施监管提供了实验技术支撑。

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