泰乐菌素组分稳定性研究

王婷，王鸿发，刘万莲，马文军

(宁夏泰益欣生物科技股份有限公司，宁夏 银川 750205)

0 引言

泰乐菌素(Tylosin)，又称泰乐星、泰乐霉素，是由弗氏链霉菌产生的十六元大环内酯类抗生素。泰乐菌素是我国畜禽养殖业防治支原体疾病的理想药剂，也是一种优良的饲料添加剂。泰乐菌素主要由4种成分组成[1-2]，分别为泰乐菌素A、脱碳霉糖泰乐菌素B、大菌素C和雷洛菌素D。4种生物活性组分的含量是衡量泰乐菌素发酵产物的标准，根据《中国兽药药典》规定，泰乐菌素A含量必须达到80%，总组分含量必须超过95%才能合格。相关研究表明，发酵初期，菌体主要以产泰乐菌素A为主，后期菌体产物主要是大菌素C[3]。泰乐菌素的4种组分中，泰乐菌素A生物活性最强，因此在发酵后期，需要将大菌素C向泰乐菌素A定向转化。在转化过程中，大菌素C的含量越高，转化时间越长，严重影响泰乐菌素的发酵时长。如何将泰乐菌素发酵液中的大菌素C高效转化使泰乐菌素的A组分及总组分含量稳定提高成为目前急需解决的技术难关。

1 仪器与试剂

1.1 实验试剂

豆油、菜籽油、玉米油、花生油、三甲铵乙内酯、乙酸钠、丙酸钠、丙二酸钠、柠檬酸钠、氨基酸，均为工业级。

1.2 实验仪器

实验中所用仪器如表1所示。

表1 实验仪器

2 材料与方法

2.1 实验材料

泰乐菌素菌种由宁夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

2.2 实验方法

2.2.1 碳源对泰乐菌素组分含量的影响

以豆油为对照，同比例玉米油、菜籽油、花生油为实验组，替代发酵培养基中的碳源，采用HPLC法检测泰乐菌素组分含量。

2.2.2 氮源对泰乐菌素组分含量的影响

以补加鱼粉为对照，实验组直接补加氨基酸，其添加异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸比例为1.0∶1.5∶2.0，采用HPLC检测泰乐菌素组分含量。

2.2.3 三甲铵乙内酯添加时间对泰乐菌素组分含量的影响

从发酵初期开始，设置时间梯度，每隔4 h在基础培养基中添加0.20%三甲铵乙内酯，以0 h为对照，采用HPLC法检测不同时间添加三甲胺乙内酯的泰乐菌素组分含量。

2.2.4 前体物质对泰乐菌素组分含量的影响

在发酵培养基中添加0.20%前体物质(乙酸钠、丙酸钠、丙二酸钠、柠檬酸钠)，以不添加任何前体物质的实验组为对照，采用HPLC法检测泰乐菌素组分含量。

2.2.5 pH对泰乐菌素组分含量的影响

pH值采用pH酸度计测定，采用HPLC法检测泰乐菌素组分含量。

2.3 HPLC检测方法

色谱柱为ODS柱，流动相为0.85 mol/L NaCl、40%乙腈溶液，pH值为2.5，流速为1 mL/min，检测波长为290 nm。

2.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010进行实验数据处理分析。

3 结果与分析

3.1 碳源对泰乐菌素组分含量的影响

碳源作为抗生素合成的重要原料之一，主要提供细菌生长代谢所需的能量，组成菌体细胞并生成代谢产物[4]。工业生产中常以豆油作为泰乐菌素发酵的主要碳源，而优质豆油价格较高，在泰乐菌素发酵成本中占很大比例。为了结合生产需要、进一步控制生产成本，需筛选质优价廉的碳源。以豆油为对照，玉米油、菜籽油、花生油按同比例作为实验碳源，研究其对泰乐菌素组分含量的影响，具体实验结果如表2所示。

表2 不同碳源对泰乐菌素组分含量的影响

由表2可得，花生油作为泰乐菌素发酵碳源时效果最好，A组分、总组分含量高达90.05%、93.09%，分别较对照组高出0.96%、0.94%，C组分含量较对照组降低0.09%；其次为菜籽油，A组分和总组分含量较对照组提高0.49%和0.74%，C组分含量较对照组降低0.04%；玉米油最差，A组分和总组分含量均低于对照组，C组分含量升高。当前原辅料市场中，花生油的售价远高于菜籽油，因此综合考虑发酵组分和发酵成本，采用菜籽油作为泰乐菌素发酵所用碳源。

3.2 氮源对泰乐菌素组分含量的影响

鱼粉是一种有机氮源，通常在泰乐菌素生产过程中用作培养基氮源，其含有多种游离氨基酸。缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸作为泰乐菌素合成的目的氨基酸，对其生物合成起促进作用，其余氨基酸不直接参与泰乐菌素的合成，故对泰乐菌素的组分含量无明显影响[5]。因此以补加鱼粉为对照，按1.0∶1.5∶2.0比例补加异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸为实验组，进行发酵实验。具体结果如表3所示，在培养基中直接补加氨基酸时，可显著提升泰乐菌素A组分及总组分含量，其A组分及总组分含量分别较对照组高出1.80%、0.76%，C组分含量较对照组降低0.08%。

表3 不同氮源对泰乐菌素组分含量的影响

3.3 三甲铵乙内酯对泰乐菌素组分含量的影响

三甲铵乙内酯是泰乐菌素生产的重要原料，其含有3个活性甲基，是有效的甲基供体，为泰乐酯合成提供前体物质，加快泰乐菌素生物合成。为了研究三甲铵乙内酯添加时间对泰乐菌素组分含量的影响，以0 h补加甜菜碱盐酸盐的实验组为对照，设置6个周期梯度，进行发酵实验，具体实验结果如表4所示。

表4 三甲铵乙内酯对泰乐菌素组分含量的影响

由表4可知，随着发酵周期的延长，泰乐菌素组分含量呈先增高后降低趋势，在发酵开始4 h补加三甲铵乙内酯时，所得泰乐菌素C组分含量最低，A组分及总组分含量均达到最高，分别较对照组高出2.06%、0.89%，说明添加三甲铵乙内酯后，可有效提高组分之间的相互转化，促进泰乐菌素A组分的生成。

3.4 前体物质对泰乐菌素组分含量的影响

在泰乐菌素生物合成的过程中，主要以内酯环的合成为主，而内酯环是由短链脂肪酸缩合而成[5]。在发酵培养基中添加0.20%前体物质(乙酸钠、丙酸钠、丙二酸钠、柠檬酸钠)，并以不添加任何前体物质的实验组为对照，考察不同短链脂肪酸对泰乐菌素组分含量的影响，具体实验结果如表5所示。

表5 前体物质对泰乐菌素组分含量的影响

由表5可知，在发酵培养基中添加4种前体物质均提高了泰乐菌素A组分、总组分含量，其中添加丙二酸钠对泰乐菌素组分含量影响最为显著，A组分、总组分含量高达90.65%、93.78%，较对照组高出1.61%、1.41%，C组分含量相比对照组降低0.15%。

放线菌产素过程中，发酵前期产生的初级代谢产物用于维持菌体生长和代谢，到发酵中后期才会大量合成并积累抗生素[6]。因此设置时间梯度进一步分析前体物质对泰乐菌素组分含量的影响。如表6所示，在发酵12 h添加丙二酸钠时，泰乐菌素总组分含量高达92.94%，较对照组提高0.78%，A组分含量较对照组提高1.77%，C组分含量较对照组降低0.12%，随着发酵时间的延长，添加丙二酸钠后A组分和总组分含量呈降低趋势，相应的C组分含量升高。

表6 前体物质添加时间对泰乐菌素组分含量的影响

3.5 pH值对泰乐菌素组分含量的影响

发酵液pH值会影响菌体的酶活性，进而影响菌体的生长和产物的合成[7]。如表7所示，泰乐菌素A组分含量随发酵液pH值的升高呈现先升高后降低趋势，大菌素C含量变化趋势相反，当pH值为7.0时，泰乐菌素A组分、总组分含量最高，达到90.40%、92.79%，当泰乐菌素发酵pH值控制在7.0～7.2范围时，泰乐菌素A组分及总组分含量相对稳定。

表7 pH 值对泰乐菌素组分含量的影响

4 结论

通过对泰乐菌素发酵培养基的主要碳源、氮源、前体物质种类及工艺条件等进行优化，探讨发酵培养基成分对泰乐菌素组分含量的影响，结果表明，当发酵液pH值为7.0时，可明显促进大菌素C向泰乐菌素A转化，泰乐菌素A含量明显增高；花生油为碳源时，泰乐菌素A及总组分含量最高，大菌素C含量降低，其次为菜籽油，玉米油最差，因花生油的售价昂贵，因此选择质优价廉的菜籽油为泰乐菌素发酵所用碳源；异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸按1.0∶1.5∶2.0比例作为氮源补料时，泰乐菌素A组分及总组分含量较对照组明显增高，大菌素C含量相应降低，证明直接补加3种氨基酸可明显促进泰乐菌素的合成；在发酵开始4 h向发酵液补加0.15%的三甲铵乙内酯、12 h后添加0.20%的丙二酸钠，泰乐菌素A组分、总组分均出现了不同程度的增高，大菌素C含量降低。实验结果说明发酵培养基中的基础成分主要用于满足菌体生长，而前体物质和代谢中间体的添加可促进菌株的代谢向泰乐菌素合成的方向移动，进而促进泰乐菌素A的生成，有效控制组分C的含量，使总组分含量达到稳定。