恩度联合化疗对不同Stat6活化表型直结肠癌细胞的作用

杨贤子 程甜甜 骆志国 蒋 飞 柴海霞 张文杰

信号传导和转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription，Stat)为一类双功能分子，即参与信号传导，又激活基因转录。Stat6分子可通过调节细胞分化增殖、诱导凋亡而对靶细胞发挥重要作用［1］。用半定量凝胶迁移法(EMSA)将人直结肠癌细胞HT-29和Caco-2分为不同的Stat6活化表型，HT-29指定为Stat6high表型，而Caco-2为Stat6null表型。与HT-29细胞相比，Caco-2细胞表现出较高的自然凋亡率［2］。进一步研究发现高自然凋亡率的Stat6null表型的Caco-2细胞表现出较高的化疗敏感性［3］。重组人血管内皮抑制素注射液(endostar，YH-16，恩度)能够特异性作用于血管内皮细胞，抑制内皮细胞的迁移和诱导其凋亡，从而直接发挥抑制血管生成和间接导致肿瘤细胞休眠或退缩的作用［4，5］。本研究旨在观察不同Stat6表型的直结肠癌细胞对恩度联合化疗药物敏感性的差异，为直结肠癌化疗和分子靶向治疗疗效的评价提供1种潜在的指标。

1 材料与方法

1.1 细胞株

本实验所用结肠癌细胞株HT-29和Caco-2购自美国典藏中心(ATCC)，用含10%小牛血清、青霉素100 U/ml和链霉素100 mg/ml的RPMI-1640培养液(JRH)，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2 主要的试剂

人重组内皮抑制素注射液［商品名:恩度，150 mg/ml，惠赠于先声药业(国药准字 S20050088)］于－4℃保存，使用时加入生理盐水稀释或加入完全培养基至所需浓度。用于流式细胞仪检测细胞早期凋亡的试剂盒(包括Annexin V和PI染液)购自深圳晶美生物技术有限公司。氟尿嘧啶注射液(5-Fu，国药准字H50020128)，西南药业股份有限公司，规格10 ml∶0.25 g。奥沙利铂注射液(艾恒，OXP，国药准字H20000337)，江苏恒瑞医药股份有限公司，规格50 mg。基于我们以前的研究结果，本试验中加入到细胞培养基中的5-Fu和奥沙利铂的化疗药物浓度分别为100 μg/ml，45 μg/ml［3］。

1.3 MTT检测恩度联合化疗药物对癌细胞的增殖抑制

选取对数生长期的Caco-2和HT-29细胞，制备成浓度为6×104/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔200 μl。实验设试剂对照组、肿瘤细胞对照组及4个实验组(因本课题的实验设试剂对照组和肿瘤细胞对照组的试验结果与我们前期的研究结果相近［3］，故在本文的结果中未展示)。4个实验组分别为恩度单药组、恩度+5-Fu(100 μg/ml)化疗组、恩度+OXP(45 μg/ml)化疗组、恩度 +5-Fu(100 μg/ml)+OXP(45 μg/ml)联合化疗组，其中每个实验组中所加入恩度的终浓度为 50 μg/ml，100 μg/ml，200 μg/ml，400 μg/ml，每一浓度梯度设6个平行孔。接种于96孔培养板中的癌细胞先在37℃、5%CO2条件下培养24 h使其贴壁生长。后在加入上述不同浓度的恩度和化疗药物继续在37℃、5%CO2条件下培养48 h。于实验终止前4 h加入MTT液20 μl/孔，继续培养至实验结束。弃上清，每孔加DMSO 100 μl后，10 min内在全自动酶标仪上室温避光振荡混匀，测定各孔波长570 nm处的光密度值(D570)。实验重复3次，取均值。细胞生长抑制率(CI)=(1－实验组平均D570值/细胞对照组平均D570值)×100%。

1.4 流式细胞术检测恩度联合化疗药物对癌细胞早期凋亡率的影响

将对数生长的2株直结肠癌细胞Caco-2和HT-29细胞分别接种于6孔培养板上(每孔1×106个细胞)，RPMI-1640培养基孵育24 h后，将不同实验组的药物分别加入孔内，继续在37℃、5%CO2条件下培养48 h。每一浓度梯度设3个平行孔。收集各处理组癌细胞，用PBS洗涤细胞2次，收集1×105个细胞。按照生产商(深圳晶美生物技术有限公司)说明书进行Annexin V/FITC及PI染色:加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μl AnnexinV/FITC混匀后，再加入PI 10 μl，漩涡混匀，室温避光染色 15 min;加入 300 μl结合缓冲液，然后用流式细胞仪(CytomicsTMFC500，美国Beckman Coulter公司)取10，000个细胞分析癌细胞凋亡及存活情况。

1.5 统计学方法

用SPSS 13.0软件进行统计学处理，统计数据用均数±标准差(M ±SD)表示。组间比较用独立样本的t检验(independent sample t-test)和单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同药物组对2种直结肠癌细胞的增殖抑制作用

由图1和图2可以得出，4种不同浓度的恩度单药对直结肠癌细胞株 Caco-2的抑制率分别为:21.0%，28.5%，24.8%，27.4%;对 HT-29 细胞的抑制率分别为:10.2%，14.1%，11.3%，16.7%;结果均没有显示出单药恩度对癌细胞明显的增殖抑制作用(P＞0.05)。而4种不同浓度的恩度联合5-Fu(100 μg/ml)药物组对Caco-2细胞的抑制率分别为:39.5%，48.5%，58.7%，65.3%;对 HT-29 细胞的抑制率分别为:26.5%，31.9%，44.4%，53.8%。而恩度联合奥沙利铂(45 μg/ml))对 Caco-2细胞的抑制率分别为:38.0%，40.5%，44.7%，56.6%;对 HT-29 细胞的抑制率分别为:30.1%，31.1%，38.4%，42.6%。分析发现与单药恩度相比，恩度联合1种化疗药物对癌细胞的生长抑制率明显升高(P＜0.05)，且可观察到协同抑制作用。4种不同浓度的恩度联合2种化疗药物(5-Fu和奥沙利铂)对 Caco-2细胞的抑制率分别为:51.3%，57.8%，73.8%，83.2%，对 HT-29 细胞的抑制率分别为:41.8%，47.2%，58.1%，67.7%。与恩度联合1种化疗药物对比，联合2种化疗药物后恩度表现出更加显著的生长抑制作用(P＜0.01)。联合1种或2种化疗药物的恩度对癌细胞的生长抑制作用呈现出浓度依赖性，不同浓度存在统计学的差异(P＜0.05)。

图1 不同浓度的恩度联合化疗对直结肠癌细胞株Caco-2的生长抑制作用

图2 不同浓度的恩度联合化疗对直结肠癌细胞株HT-29的生长抑制作用

2.2 不同药物组对2种直结肠癌细胞早期凋亡的影响

由图3和图4可见，4种不同浓度的恩度单药对直结肠癌细胞株Caco-2早期凋亡率的影响分别为:17.3%，15.2%，19.3%，17.4%;对 HT-29 细胞早期凋亡率的影响分别为:6.5%，7.5%，5.7%，8.7%。结果提示单药恩度并不能促进癌细胞的凋亡(P＞0.05)。而4种不同浓度的恩度联合5-Fu(100 μg/ml)药物组对Caco-2细胞早期凋亡率的影响分别为:31.2%，45.1%，51.8%，62.0%;对 HT-29 细胞早期凋亡率的影响分别为:19.6%，25.7%，35.5%，48.3%。而恩度联合奥沙利铂(45 μg/ml))对Caco-2细胞早期凋亡率的影响分别为:28.2%，37.7%，39.5%，49.7%;对HT-29细胞早期凋亡率的影响分别为:20.5%，18.3%，26.4%，43.2%。分析发现与单药恩度相比，恩度联合1种化疗药物后其促进癌细胞的凋亡能力明显升高(P＜0.05)。4种不同浓度的恩度联合2种化疗药物(5-Fu和奥沙利铂)对Caco-2细胞早期凋亡率的影响分别为:45.3%，55.2%，75.8%，87.3%;对HT-29细胞早期凋亡率的影响分别为:29.3%，47.6%，59.2%，70.6%。与恩度联合1种化疗药物对比，联合2种化疗药物后恩度表现出更加显著的促进癌细胞凋亡的能力(P＜0.01)。流式细胞仪结果与MTT检测出细胞生长抑制率的结果是一致的，同时也提示恩度与5-Fu和OXP可以表现出更好的协同抑制作用。

2.3 2种不同Stat6表型的直结肠癌细胞对不同药物组存在增殖抑制和凋亡增加的差异

我们以前的研究发现Stat6high表型的HT-29细胞显示出比Stat6null表型Caco-2细胞更强的自然抗凋亡能力和对抗化疗药物诱导细胞凋亡的能力［3］。将图1和图3与图2和图4对比，我们不难发现Caco-2细胞对恩度联合化疗药物(1种或2种)的细胞生长抑制率和早期凋亡率均高于HT-29细胞(P＜0.05)，其中恩度联合2种化疗药物的作用最显著(P＜0.001)。

图3 不同浓度的恩度联合化疗对直结肠癌细胞株Caco-2早期凋亡的影响

图4 不同浓度的恩度联合化疗对直结肠癌细胞株HT-29早期凋亡的影响

3 讨论

晚期直结肠癌患者的治疗是以化疗为主的多种手段相结合的综合治疗。FOLFOX4方案(奥沙利铂+CF+5-Fu)是目前国际上公认的晚期直结肠癌的标准化疗方案，但其有效率仅在30%左右。近年来，随着各种分子靶向治疗药物的不断推出，分子靶向药物治疗成为晚期结直肠癌研究的新热点。国内临床研究者发现恩度与部分化疗药物之间存在一定的协同作用［6］。万德森等［7］通过临床试验发现恩度联合氟尿嘧啶具有协同作用。本研究通过肿瘤基础试验(即细胞水平的研究)发现不同浓度的恩度联合化疗药物(奥沙利铂和/或5-Fu)显示出对直结肠癌细胞较强的抑制增殖和促进凋亡的作用，特别是联合2种化疗药物，再次证实了恩度与化疗药物之间存在协同作用。

我们前期的研究发现在人类结直肠癌细胞中存在不同的Stat6活化表型［2］，而这一现象同样存在于多种恶性肿瘤细胞中(如:霍奇金淋巴瘤和纵隔B细胞淋巴瘤)。国外研究者对后两种细胞株研究证实，有功能的Stat6细胞可能由于逃避了免疫监视而有利于肿瘤生长［8，9］。我们的研究也观察到了 Stat6high表型的乳腺癌细胞株ZR-75-1和直结肠癌细胞株HT-29和SW480都具有较高的自然抗凋亡能力和对化疗药物的低敏感性，而Stat6null表型的直结肠癌细胞株Caco-2和Lovo则表现出高早期凋亡率和对化疗药物(5-Fu和奥沙利铂)高敏感的特性［3，10］。这表明Stat6信号传递通路在调节多种癌细胞的增殖和凋亡方面起着重要的作用。本研究在2种化疗药物的基础上加入分子靶向药物--恩度，结果发现与Stat6high表型的直结肠癌细胞HT-29相比，Stat6null表型的Caco-2细胞表现出更高的细胞生长抑制率和早期凋亡率。这暗示Stat6null表型或Stat6基因缺失的癌细胞不仅具有较高的自然凋亡率和对化疗药物的敏感性，而且具有对恩度联合化疗药物更强的敏感性。

综上所述，本研究从细胞水平证实了分子靶向药物恩度联合化疗药物对直结肠癌细胞较强的抑制增殖和促进凋亡的作用。因此，恩度联合FOLFOX4方案一线化疗方案治疗晚期直结肠癌患者有较好的疗效，值得临床上推广。同时本研究也发现Stat6null表型的直结肠癌细胞表现出对恩度联合化疗药物更强的敏感性，暗示着不同Stat6活化状态可能成为判断肿瘤生物学特性及临床化疗和分子靶向治疗疗效评价的新指标之一。

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