NS398对SGC7901胃癌细胞生长及CD44V6、MMP-9基因表达的影响

双金权 吴 婷 庄则豪

环氧合酶-2(cyclooxygenase-2)是环氧合酶的1种异构体，正常生理情况下在机体多数组织中不表达，可被多种刺激物如有丝分裂原、细胞因子等刺激而表达［1］。近年来，多项研究发现COX-2在胃癌组织中呈高表达，且与胃癌的侵袭、转移有关［1，2］，且 COX-2 抑制剂能抑制肿瘤的生长、转移［3，4］。本实验观察了COX-2特异性抑制剂-NS398(分子式C13H18N2O5S，购于Cayman Chemical USA)对胃癌细胞CD44V6、MMP-9基因表达的影响，探讨COX-2抑制剂抑制胃癌侵袭、转移的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃腺癌细胞株SGC7901引自福建医科大学药理学教研室。RPMI 1640培养基(Gibco公司)，新生小牛血清(杭州四季青公司)，NS398(分子式C13H18N2O5S Cayman，USA)，酶联免疫吸附试剂盒(Cayman chemical，USA)，Trizol(lifescience technology)，逆转录试剂盒，TaqDNA聚合酶(晶美公司)，DMSO(sigma)，MMP-9、CD44V6单克隆抗体(福州迈新公司)。

1.2 细胞培养

SGC7901细胞贴壁生长于含10%热灭活小牛血清的1640培养基中，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2～3天0.25%胰酶消化传代。

1.3 免疫细胞化学检测 COX-2、CD44V6、MMP-9蛋白表达

取对数生长期SGC7901胃癌细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，苔盼兰染色细胞成活率大于98%后，在清洁6孔板的每孔底部平放1片清洁的盖玻片，再按每孔2×105个细胞将胃癌细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后再培养24 h，取出盖玻片，PBS冲洗数次，4℃冷丙酮固定10 min，PBS冲洗3次，每次3～5 min。按说明书步骤常规行S-P法染色。结果判定:细胞膜及胞质出现棕黄色颗粒为阳性。

1.4 酶连免疫吸附实验

细胞生长至培养瓶70%～80%时更换新鲜培养基，并在实验组中加入不同量的NS398储存液使培养液终浓度分别为 1、10、100、200 μmol/L，再继续培养24 h，吸取培养上清液 500 μl，12 000 r、4℃离心 5～10 min，去除细胞碎片。实验步骤参照试剂盒说明书进行。上清液经1∶10稀释后加入检测PGE2的96孔板中，各样本在ELISA检测仪中读取450 nm处的吸光值，并根据试剂盒中提供的标准蛋白描绘出标准曲线并计算各样本的PGE2含量。每个浓度设3个复孔，实验重复3次。

1.5 MTT检测NS398对胃癌细胞生长的影响

取对数期生长的SGC7901胃癌细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，按5×103个细胞/孔，接种于96孔板中，常规培养24 h，更换新鲜培养液并加入NS398，使各组培养液中 NS398浓度分别为 0、50、100、200 μmol/L。分别在加药后24、48、72 h倾去培养基，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，继续孵育4 h。每孔加入150 μL的DMSO，振荡10 min，应用酶连免疫检测仪读取每孔的吸光度(A0)值(λ实验=490 nm，λ参考=630 nm)。细胞增殖抑制率(%)=［1－(实验组)/(对照组)］×100%。实验重复3次，每次、每浓度、每时间点均设3个复孔。

1.6 总RNA提取

SGC7901胃癌细胞胰酶消化制成单细胞悬液，按5×105个细胞/瓶，接种于25 ml培养瓶中，常规培养过夜，待细胞贴壁后更换培养基，并加入一定量的NS398，使终浓度为 10、100、200 μmol/L，继续培养24 h，倾去培养基，0.25%胰酶消化、离心收集细胞，按105～106个细胞/1 ml Trizol加入Trizol，反复吹打至细胞完全溶解，按说明书进行总RNA提取，测 OD260/OD280≥1.80，说明RNA完整性良好，行PCR扩增。

1.7 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

参照试剂说明书取总RNA 2 μg作逆转录反应，逆转录反应体系 20 μl:mRNA 2 μg，MgCL24 μl，dntp 2 μl ，amv 0.75 μl，oligo 1 μl，rnasin 0.5 μl，distilled water 补足20 μl。反应条件:42℃ 1 h，95℃ 5 min。取逆转录反应产物2 μl进行PCR反应，以β-actin作为内参照。参照文献，各引物序列为:CD44V6［5］(129 bp)，P1:5 ＇-tccaggcaactcctagtagt-3，P2:5-cagctgtccctgttgtcgaa-3。MMP-9［6］(494 bp)，P1:5-tgggagcatggcgatggata-3，P2:5-acagtggacatggcggtctca-3。CD44V6 反应体系50 μl:10 × bufferul 5 μl，10 mM dNTP 4 μl，MgCL23 μl(25 mM)，cDNA 2 μl，Taq 酶 2U，β-actin 上下游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，CD44V6 上下游引物各 2 μl(10 pmol/μl)，去离子水补足至 50 μl。在 9 700 型PCR扩增仪(Bechman)上进行PCR扩增，94℃预变性5 min后开始PCR循环:95℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共扩增32个循环。最后72℃延伸10 min。MMP-9 反应体系50 μl:10 × bufferul 5 μl，10 mM dNTP 4 μl，MgCl23 μl(25 mM)，cDNA 2 μl，Taq 酶 2 U，β-actin 上下游引物各 0.5 μl(10 pmol/μl)，MMP-9上下游引物各2 μl(10 pmol/μl)，去离子水补足至50 μl。将反转录产物于95℃预变性5 min后，开始PCR热循环:反应条件:95℃45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸1 min，共扩增35个循环，末次72℃延伸10 min。取8 μl产物加2 μl溴酚兰混合后经0.2%琼脂糖凝胶电泳，图像分析仪扫描得出峰值，进行半定量分析，以CD44V6/β-actin、MMP-9/β-actin 作为其 mRNA 表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 胃癌细胞中COX-2、CD44V6、MMP-9表达情况

免疫细胞化学结果发现，COX-2、CD44V6、MMP-9在SGC7901胃癌细胞中呈阳性表达，其中 COX-2、MMP-9主要是胞质染色，CD44V6主要是细胞膜呈阳性染色，且三者表达强度较强。

2.2 不同浓度NS398对胃癌细胞产生PGE2的影响

ELISA试验发现，NS398可有效抑制SGC7901胃癌细胞PGE2的分泌水平。与对照组比较，当NS398浓度达10 μmol/L时，开始出现 SGC7901胃癌细胞PGE2分泌水平下降，NS398浓度为200 μmol/L时能显著抑制胃癌细胞PGE2的分泌，PGE2分泌水平下降了64.3%，NS398对SGC7901胃癌细胞PGE2分泌水平抑制作用呈浓度相关性，见表1和图1。

图1 NS398作用后胃癌细胞PGE2分泌水平的变化

表1 不同浓度NS398作用后胃癌细胞PGE2分泌水平变化

2.3 NS398对胃癌细胞生长的影响

不同浓度NS398作用不同时间，实验组A0值均小于对照组，而DMSO(200 μmol/L)组与空白对照组比较无显著性差异(P＜0.01)，因此，DMSO对胃癌细胞的生长无影响。当NS398浓度为50 μmol/L时，SGC7901胃癌细胞生长出现抑制效应，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。200 μmol/L NS398作用24 h细胞生长抑制率为30.5%，48 h为29.5%，72 h为42.9%。且发现NS398对胃癌细胞增殖抑制率随其浓度的增高而增高;其中200 μmol/L NS398作用72 h对细胞增殖的抑制率最高，为42.9%，见表2、3。

表2 不同浓度NS398作用不同时间后对SGC7901胃癌细胞生长的影响

表3 不同浓度NS398作用不同时间后SGC7901胃癌细胞增殖抑制率(%)

2.4 NS398对胃癌细胞中CD44V6、MMP-9基因表达的影响

NS398作用24 h后，与对照组比较，DMSO(200 μmol/L)组CD44V6、MMP-9基因表达水平无明显变化(P＜0.05)，DMSO 对胃癌细胞中 CD44V6、MMP-9基因表达无影响;而各实验组mRNA相对表达量均低于对照组;200 μmol/L NS398作用24 h时，胃癌细胞中CD44V6、MMP-9基因表达水平分别下降45.7%和43.6%。NS398能在基因表达水平上抑制 CD44V6、MMP-9表达，且这种抑制效应与 DMSO无关，是由NS398 作用引起的，见表4，图2、3、4。

图2 SGC7901胃癌细胞中各目的基因的表达

表4 NS398对胃癌细胞中CD44V6、MMP-9基因表达的影响(/β-actin)

图3 NS398作用后SGC7901胃癌细胞CD44V6基因表达变化

图4 NS398作用后SGC7901胃癌细胞MMP-9基因表达变化

3 讨论

近年研究发现，COX-2高表达与胃癌等多种肿瘤发生有关，COX-2高表达不仅促进了肿瘤的发生，且能促进肿瘤的侵袭和转移［2，7，8］，也有研究发现 COX-2 抑制剂可抑制某些肿瘤细胞的黏附运动和侵袭性［4］。

NS398是1种特异性的COX-2抑制剂，可有效抑制前列腺素(PGs)的产生。在实验中应用酶联免疫吸附检测NS398对SGC7901胃癌细胞分泌前列腺素-2(PGE2)水平的影响，发现NS398可有效抑制SGC7901胃癌细胞PGE2的产生，且抑制程度随浓度增加而增强。200 μmol/L NS398作用24 h，胃癌细胞前列腺素分泌水平下降64.3%。NS398能有效抑制COX-2的PGE2的产生，从而阻断COX-2的作用。

吴汉平等［9］将COX-2反义RNA转染到胃癌细胞后，与对照组相比，胃癌细胞生长显著受抑制。可见COX-2参与了肿瘤生长的调控。Cheng等［10］观察NS398对肝细胞癌生长的影响，发现NS398呈剂量依赖性抑制Hep3B和HKCI-4细胞的增殖，100 μmol/L使Hep3B细胞增殖下降17%，HKCI-4细胞下降15%。国内王纯雁等［11］也观察到NS398能显著抑制卵巢癌细胞的增殖。MTT试验是1种有效的间接检测细胞生长的方法，我们在实验中应用MTT法检测NS398对SGC7901胃癌细胞生长的影响，发现不同浓度NS398作用不同时间胃癌细胞的生长均受抑制。当NS398的浓度为50 μmol/L时开始出现对SGC7901胃癌细胞增殖的抑制效应，且抑制效应随其浓度增加而增强。其中200 μmol/L作用72 h对细胞增殖的抑制率为42.9%，充分显示了NS398抑制SGC7901胃癌细胞体外生长的效应。

肿瘤细胞与基质的黏附及基质的降解是肿瘤侵袭、转移过程中的重要步骤，其中包括黏附分子CD44及基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的参与。MMP-9能降解基质便于肿瘤细胞的移动、侵袭。Yu等［12］认为CD44V6作为MMP-9在细胞表面的附着点，以确保CD44介导的肿瘤浸润与转移。Tsujii等［13］发现转染COX-2基因的结肠癌细胞表现出明显的侵袭性，而抑制COX-2表达可见癌细胞运动、侵袭能力下降。Pan等［14］发现COX-2抑制剂可显著抑制肺癌细胞的侵袭、运动能力及 CD44V6、MMP-2的基因表达，而对MMP-9基因表达无影响。但Yao等［15］研究发现COX-2选择性抑制剂NS398(100 mmol/L)能显著降低高转移性鼠结肠癌细胞MC-26侵袭性，且MMP-2及MMP-9的蛋白表达水平及酶活性均下降25%～30%，且癌细胞肝转移被延缓。我们在实验中运用RT-PCR检测NS398作用于 SGC7901胃癌细胞24 h后 CD44V6、MMP-9基因表达水平的变化，发现经NS398作用后，胃癌细胞CD44V6、MMP-9基因表达水平有不同程度下降。200 μmol/L NS398 作用 24 h，胃癌细胞CD44V6、MMP-9基因表达分别下降45.7%和43.7%。COX-2特异性抑制剂NS398抑制了SGC7901胃癌细胞CD44V6、MMP-9基因的表达。CD44V6、MMP-9基因是肿瘤细胞侵袭与转移过程中的重要分子，因此，COX-2可能在促进胃癌侵袭、转移的过程中发挥一定的调节作用，有可能是调节胃癌侵袭、转移过程的一个靶点。

NS398可抑制COX-2酶的活性、阻止PGs的产生和释放，因此，NS398抑制CD44V6、MMP-9表达与PGs的阻断有关。有研究发现［16］，经PGs作用后，肺癌细胞前列腺素的EP4上调，且伴随CD44V6、MMP-2基因表达水平的升高，而抑制 PGs的释放，可见 EP4、CD44V6、MMP-2表达水平下降;而且发现若使细胞内cAMP水平升高，则 CD44、MMP-2表达上调，可见PGs、EP4、cAMP 参与 COX-2 对 CD44V6、MMP-2 基因表达的调节，而PGs并不能完全逆转这种作用，可能NS398本身对CD44、MMP-2基因表达有抑制作用，但具体在胃癌中的作用机制需进一步探讨。本实验中发现NS398作用SGC7901胃癌细胞后，其CD44V6、MMP－9基因表达水平下降，但尚不明确这一作用是否为COX-2依赖性，其可能的具体信号转导途径需要进一步的实验研究来明确。

本实验发现，COX-2特异性抑制剂NS398可抑制CD44V6、MMP-9的基因表达，而CD44V6、MMP-9是促进胃癌侵袭、转移的重要分子。COX-2及其抑制剂在胃癌侵袭与转移中的作用值得进一步研究，COX-2可能是胃癌侵袭、转移调节过程中的一个新靶点，COX-2特异性抑制剂NS398可能成为新的抑制肿瘤侵袭与转移的药物。可以设想，COX-2抑制剂将为胃癌的治疗提供新的思路。

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