重组蜂毒肽对胶质瘤SHG44细胞的抑制作用及对STAT3、VEGF表达的影响

姚兴军 王岳华 侯文仲 邓光策 曾敏敏 关北漩 (清远市人民医院神经外科，广东 清远 511518)

蜂毒肽(Melittin)又称蜂毒溶血肽，是蜂毒(Bee venom)的主要活性成分，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗辐射等作用〔1〕。近年来有关蜂毒肽抗癌作用的报道增多，引起了广泛的关注〔2，3〕。但是天然蜂毒肽来源有限，成本极高，使其应用受到影响〔1〕，因此逐渐倾向于用人工重组的蜂毒肽代替天然提取的蜂毒肽使用。本实验研究重组蜂毒肽(Recombinant melittin)对人胶质瘤细胞SHG44的抑制作用，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和材料 人胶质瘤细胞SHG44来自中国医学科学院协和细胞库;重组蜂毒肽由本实验室合成制备;胰蛋白酶、RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清(FBS)、血管内皮生长因子(VEGF)兔抗鼠多克隆抗体购自美国Gibco公司，其他试剂及试剂盒均由美国Sigma公司提供。

1.2 SHG44胶质瘤细胞的培养 将SHG44胶质瘤细胞培养在含10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，用0.25%胰酶消化传代，取对数生长的细胞进行试验。

1.3 MMT法检测重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞的抑制作用 取对数生长的SHG44胶质瘤细胞，0.25%胰酶消化，将细胞浓度调整至 1×106/ml，然后接种于 96孔板中(每孔100 μl)，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后分别加入不同浓度的重组蜂毒肽(20、40、80 mg/L)，每个浓度设置5个复孔，放置细胞培养箱中继续培养，分别于重组蜂毒肽加入后24、48、72 h后弃去上清液，各孔分别加入20 μl四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液，继续培养4 h后，小心弃去培养液，每孔中分别加入150 μl DMSO，震荡10 min后，置于酶标仪中于490 nm波长处测定各孔的吸光度(A)，不加细胞的空白溶液调零。对照组除不加入重组蜂毒肽外，其他与实验组同法操作。同时，分别计算不同浓度的重组蜂毒肽作用24、48、72 h后对胶质瘤细胞生长的抑制率，抑制率 =(1－A实验组/A对照组)×100%。

1.4 Western印迹法测定细胞信号转导和转录活化蛋白3(STAT3)、VEGF蛋白的表达〔4〕取对数生长的SHG44胶质瘤细胞，经0.25%胰酶消化，将细胞浓度调整至1×106/ml，然后接种于96孔板中(每孔100 μl)，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后，分别加入不同浓度的重组蜂毒肽(20、40、80 mg/L)，每个浓度设置6个复孔，同时设不加入重组蜂毒肽的对照组。继续培养72 h后，停止培养，用PBS洗板2次，加入细胞裂解液，置于冰上裂解20 min，于4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液，进行蛋白定量，经8%SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜，进行抗体标记、成像显影、漂洗(以β-actin蛋白为内参)，采用图像分析软件测定记录各条带的吸光度(A)，以不加入细胞的空白溶液调零。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0进行分析，数据用s表示，采用单因素方差进行处理，组间比较采用SNK检测法。

2 结果

2.1 重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞的抑制作用 MMT实验结果表明:重组蜂毒肽20、40、80 mg/L作用于SHG44胶质瘤细胞48、72 h后，对细胞的增殖有不同程度的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，其中以40、80 mg/L两个剂量组抑制作用尤为显著(P＜0.01)，并且抑制率呈剂量依赖性。见表1。

表1 重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞的抑制作用( s，n=5)

表1 重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞的抑制作用( s，n=5)

与对照组相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 24 h吸收度(A)抑制率(%)48 h吸收度(A)抑制率(%)72 h吸收度(A)抑制率(%)对照组46.51±0.64 0.84±0.14 － 1.49±0.14 － 0.86±0.15 －低剂量组 0.82±0.12 2.38±0.22 1.39±0.051) 6.71±0.15 0.71±0.171) 15.48±0.36中剂量组 0.82±0.17 2.38±0.19 1.24±0.172) 16.79±0.33 0.58±0.162) 32.56±0.55高剂量组 0.81±0.15 3.57±0.25 1.03±0.092) 30.87±0.24 0.46±0.122)

表2 不同浓度重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞STAT3、VEGF蛋白表达的影响( s，n=6)

表2 不同浓度重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞STAT3、VEGF蛋白表达的影响( s，n=6)

与对照组组相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01

0.57±0.21 0.67±0.15低剂量组 0.54 0.18 0.59±0.16中剂量组 0.48±0.131) 0.46±0.211)高剂量组 0.37±0.192) 0.33±0.142)蛋白对照组组别 STAT3蛋白 VEGF

图1 不同浓度重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞STAT3、VEGF蛋白表达的影响

2.2 重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞STAT3、VEGF蛋白表达的影响 Western印迹结果表明，不同浓度重组蜂毒肽作用于SHG44胶质瘤细胞 72 h后，低、中、高剂量组(20、40、80 mg/L)细胞STAT3及VEGF表达均呈递减趋势，并具有剂量依赖性，其中低剂量组无统计学意义，中、高剂量组均有显著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。见图1，表2。

3 讨论

脑神经胶质瘤为常见的颅内肿瘤疾病，发病来源于神经上皮细胞，约占颅内肿瘤疾病的40% ～50%，具有发病率高、复发率高、死亡率高及治愈率低的特点〔5，6〕。目前临床常见的治疗方法有手术治疗、放射治疗、化学治疗等，其中手术治疗在恶性神经胶质瘤治疗中具有重要意义，但由于胶质瘤细胞边界不十分清晰，其手术疗效受医生临床水平及医疗条件等诸多因素的影响;放、化疗副作用较大，且应用受具体病情等条件的局限，目前仅作为配合术后加强治疗或复发治疗使用〔7，8〕。因此，对神经胶质瘤临床治疗药物及治疗机制的研究显得尤为重要。

研究表明〔9〕，在胶质瘤细胞中，STAT3高表达，STAT3可能是一种癌基因，它参与的信号转导途径异常可能在肿瘤侵袭、转移中起重要作用。此外，据有关研究报道〔10〕，在神经胶质瘤组织中，VEGF蛋白的表达明显高于正常的神经上皮组织，且神经胶质瘤的恶性程度与肿瘤组织中VEGF的含量相关性极高，因此神经胶质瘤与VEGF蛋白的表达具有极大的相关性。最新文献报道，STAT3能直接调控 VEGF的转录〔11〕，持续激活STAT3能诱导VEGF的表达，导致肿瘤新生血管形成;阻断STAT3的激活能抑制内皮细胞的迁移及微血管的形成〔12〕，提示STAT3、VEGF的协同表达很可能是胶质瘤的重要发病因素之一。本研究提示重组蜂毒肽可能是通过影响胶质瘤细胞中STAT3和VEGF蛋白的表达抑制细胞生长。

综上所述，本研究初步探讨了重组蜂毒肽对SHG44胶质瘤细胞生长的抑制作用，同时研究了其对SHG44胶质瘤细胞中STAT3、VEGF蛋白表达的影响，为重组蜂毒肽治疗神经胶质瘤疾病药物的开发提供了重要的理论依据。

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11 Cascio S，Ferla RD，Andrea A，et al.Expressionofangiogenic regulators，VEGF and leptin，is regulated by the EGF/PI3 K/STAT3 pathway in colorectal cancer cells〔J〕.J Cell Physiol，2009;221(1):189-94.

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