无针喷射控释双生长因子藻酸盐水凝胶对心肌梗死兔左室重塑及心功能的影响

周志益 黄 晶 任建丽 吴 奇 (重庆市第三人民医院老年科，重庆 40000)

心肌梗死后引起的左室重塑和心力衰竭往往与心脏细胞外基质(ECM)的广泛损伤有关〔1〕。在心肌梗死区注射生物材料(如纤维蛋白、胶原等)或与细胞治疗联合应用可能代替损伤的ECM，防止左室重塑和心力衰竭〔2，3〕。海藻酸盐由于其为天然高分子材料，具有无毒性、可降解性及良好的生物相容性而广泛应用于药物释放体系和组织工程领域，其结构与ECM相似〔4，5〕。本实验探讨无针喷射控释双生长因子藻酸盐水凝胶改善心肌梗死左室重塑和心功能的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰大白兔40只，雌雄不限，体质量2～3 kg，平均(2.67±0.49)kg，由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2 仪器与试剂 无针注射器(Injex公司，美国);iE33彩色超声诊断仪(Philips公司，荷兰);IX71倒置显微镜(Olympus公司，日本);组织切片机(Leica公司，德国);海藻酸钠(Sigma公司，美国);VEGF-A165及PDGF-BB(Sigma公司);SABC通用型免疫组化试剂盒(北京中杉金桥公司);兔抗犬CD34单克隆抗体及兔抗犬α-SMA单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)。

1.3 方法

1.3.1 海藻酸钠的修饰 Sigma公司的海藻酸钠作为高分子量海藻酸钠(Mw=2.7×105g/mol)，以5.0 Mrad钴60辐照4 h制备低分子量海藻酸钠(Mw=53 100 g/mol)。用电子天平称取高碘酸钠2.67 g，加入去离子水50 ml配制成0.25 mol/L的溶液放置于棕色瓶中备用。分别称取1 g高分子量及低分子量海藻酸钠加入到100 ml去离子水中，磁力搅拌直至海藻酸钠溶解完全，得到1%(W/V)的海藻酸钠溶液。加入预先配置好的高碘酸钠溶液1 ml，4℃避光搅拌反应24 h后加入0.2 ml乙二醇终止氧化反应15 min。然后加入0.3 g氯化钠，充分溶解后加入200 m1乙醇使其沉淀析出，并减压抽滤获得白色产物。将产物用50 ml水充分溶解后装入透析袋中透析3 d，每天换水3～4次，用电导率仪测定透析液透析完全后将透析液倒入塑料表面皿中，放入低温冰箱预冻12 h，并将预冻物冻干，最终获得部分氧化海藻酸钠白色产物。

1.3.2 藻酸盐水凝胶载体的制备及生长因子的加入 用PBS分别配制2%修饰后的高分子量及低分子量海藻酸钠溶液，VEGF-A165及PDGF-BB按照说明书要求溶解后，将VEGFA165溶于低分子量海藻酸钠溶液，PDGF-BB溶于高分子量海藻酸钠溶液，以1∶1(LMW∶HMW)的体积比将两种溶液混合。生长因子的最终浓度是每100 μl海藻酸钠混合液含3 μg VEGF-A165或(和)3 μg PDGF-BB。无菌条件下向该溶液注入氯化钙，使其Ca2+浓度为50 mmol/L，海藻酸钠分子在二价Ca2+作用下侧向交联，形成控释双生长因子藻酸盐水凝胶。

1.3.3 兔急性心肌梗死模型的建立及实验分组 以3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)耳静脉注射麻醉后，将兔仰卧固定于手术台上，四肢刺入针形电极行心电监护。用8%硫化钠脱毛，碘伏消毒，再以75%酒精脱碘，铺巾，于胸骨左缘第2～4肋间断肋，暴露纵隔及心脏，保持两侧胸膜完整，避免发生气胸，纵行切开心包，提起左心耳，于左心耳根部下方约5 mm处用4-0带线缝合针缝扎左室前降支。以左心室前壁心肌颜色变暗，搏动减弱以及心电图胸前导联出现ST段抬高为结扎成功标志。

40只实验兔造模成功后，随机分成5组:生理盐水组(无针喷射100 μl生理盐水)、藻酸盐凝胶组(无针喷射100 μl藻酸盐水凝胶)、VEGF-A165凝胶组(无针喷射 100 μl VEGFA165藻酸盐水凝胶)、PDGF-BB凝胶组(无针喷射100 μl PDGF-BB藻酸盐水凝胶)和双生长因子凝胶组(无针喷射100 μl含双生长因子藻酸盐水凝胶)。

1.3.4 形态学分析 用无针注射器于心肌梗死区及梗死周边区每孔喷射100 μl藻酸盐水凝胶或100 μl生理盐水，每只实验兔无针喷射建立5个孔道。8 w后，各组随机抽取3只实验兔经静脉注射10%氯化钾处死，测量平均瘢痕厚度。

1.3.5 超声心动图评价心功能 实验干预24 h及8 w后，用Philips iE33超声诊断仪进行经胸超声心动图检查。取胸骨旁左室长轴切面M型超声心动图测量左室舒张末内径(LVDd)、左室收缩末内径(LVDs)、缩短分数(FS)及射血分数(EF)。测量均由3个连续心动周期平均获得。

1.3.6 检测CD34的表达、微血管计数及α-SMA的表达、小动脉计数 实验干预8 w后，各组实验兔经静脉注射10%氯化钾处死，常规切片、包埋。SABC法CD34及α-SMA染色，DAB显色。根据Weidner评判标准〔6〕，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群者均作为一个血管计数，肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞的血管不计数，每张切片选择5个血管最多的区域，在400倍视野下进行计数，取均值，计数微血管密度(MVD)。判定小动脉的标准参照文献〔7〕。每张切片选择梗死区周围5个血管最多的区域，在400倍视野下进行计数，取均值，计数小动脉密度。

1.4 统计学分析 采用SPSS14.0统计分析软件和Excel进行统计分析，计量资料以s表示，多组之间比较采用方差分析，两两比较使用SNK法。

2 结果

2.1 形态学分析 凝胶组、VEGF-A165凝胶组、PDGF-BB凝胶组及双生长因子凝胶组的平均瘢痕厚度较盐水组的平均瘢痕厚度明显增厚(3.7±0.2，4.8±0.3，5.2±0.3，5.6±0.3 mm vs 1.1±0.2 mm，P ＜0.05)，而凝胶组、VEGF-A165凝胶组、PDGF-BB凝胶组及双生长因子凝胶组的平均瘢痕厚度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 超声心动图评价心功能 应用Philips iE33超声诊断仪对实验兔进行心功能评价，各组心功能比较见表1。

表1 各组兔心功能比较( s，n=8)

表1 各组兔心功能比较( s，n=8)

与其余各组8 w比较:1)P＜0.05

盐水组 凝胶组VEGF凝胶组PDGF凝胶组 双生长因子凝胶组P值0.2 0.004 P值 0.011 0.000 0.010 0.000 0.007 LVD(s，cm)0.91±0.02 1.19±0.03 0.90±0.03 1.12±0.01 0.88±0.03 1.03±0.02 0.89±0.04 1.05±0.02 0.88±0.04 0.91±0.031)0.744 0.000 P值 0.007 0.005 0.009 0.008 0.439 FS(%)28±1 20±2 27±2 24±1 29±2 28±2 28±2 27±2 28±2 34±21)0.776 0.000 P值 0.044 0.038 0.184 0.478 0.009 EF(%)51±2 38±2 50±2 44±2 53±2 51±1 51±2 50±2 51±2 59±21)0.474 0.000 P 24 h 8 w LVDd(cm)1.26±0.03 1.49±0.03 1.24±0.02 1.46±0.02 1.24±0.02 1.43±0.02 1.23±0.02 1.44±0.02 1.22±0.02 1.38±0.041)24 h 8 w 24 h 8 w 24 h 8 w 24 h 8 w 24 h 8 w 0.017 0.095 0.370 0.423 0.044

2.3 心肌微血管密度检测 实验干预8 w后，心肌梗死周边区心肌组织切片免疫组化CD34结果显示单纯凝胶组的微血管密度没有明显增加，与盐水组微血管密度比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)。而VEGF-A165凝胶组、PDGF-BB凝胶组及双生长因子凝胶组的微血管密度均有所增加，与盐水组微血管密度比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，并且双生长因子凝胶组的微血管密度增加最为明显(图1)。

2.4 心肌小动脉密度检测 实验干预8 w后，心肌梗死周边区心肌组织切片免疫组化α-SMA结果显示单纯凝胶组的小动脉密度没有明显增加，与盐水组微血管密度比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)。而VEGF-A165凝胶组、PDGF-BB凝胶组及双生长因子凝胶组的小动脉密度均有所增加，与盐水组小动脉密度比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，并且双生长因子凝胶组的小动脉密度增加最为明显(图2)。

图1 各组CD34的表达(DAB，×400)

图2 各组α-SMA的表达(DAB，×400)

3 讨论

伴随室壁压力增加的左室扩展及球样形变是心肌梗死后左室重塑的关键因素。注射生物材料能够增加瘢痕厚度及稳定心腔大小，从而减低室壁压力〔8，9〕。研究表明〔10〕，具有生物降解性的藻酸盐水凝胶能够对心肌梗死后的损伤心肌组织提供物理支持，在心肌梗死后的左室重塑时期，植入的藻酸盐水凝胶载体可使梗死区坚固，从而避免左室扩张及伸展。但是目前的研究采用直接注射心肌组织投递藻酸盐水凝胶支撑物，由于心脏是搏动的器官，有针注射不可避免地增加心肌的牵拉伤，不利于心功能的改善，甚至导致心功能恶化。

急性心肌梗死后侧支循环的开放对左室重塑及心功能的改善具有非常重要的作用。研究发现，VEGF是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，血管再生过程中VEGF介导内皮细胞的迁移、增殖以构建新生血管的管状结构。PDGF则有明显促进血管成熟的作用。血管再生过程复杂，需要众多因素参与其中，相互作用，共同调节。因此，联合治疗促进血管再生已成为研究方向。VEGF与PDGF联合应用具有明显的促进血管新生、血管成熟以及增加新生血管内径的作用，可作为一种有效的治疗性血管发生的策略〔11，12〕。

鉴于此，本研究采用无针喷射藻酸盐水凝胶支撑物，有效地避免有针直接注射所带来的心肌牵拉伤，同时将VEGF-A165溶于氧化的低分子量海藻酸钠溶液，PDGF-BB溶于氧化的高分子量海藻酸钠溶液，并混合加入钙离子交联为藻酸盐水凝胶，可以实现修饰后的藻酸盐水凝胶控制释放2种生长因子，即氧化的低分子量藻酸盐水凝胶先释放VEGF-A165，而氧化的高分子量藻酸盐水凝胶后释放PDGF-BB。这样可以通过先释放VEGF-A165促进血管壁内皮细胞层生成，首先形成具有单层细胞壁的血管结构，而后释放的PDGF-BB则进一步促进血管壁平滑肌细胞层生成，最终形成有功能的小血管。本文表明无针喷射控释双生长因子藻酸盐水凝胶较单生长因子凝胶组更有利于心肌梗死左室重塑及心功能的改善。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究的观察时间为无针喷射后8 w，应该选用更长的观察时间来证实无针喷射控释双生长因子藻酸盐水凝胶对左室重塑及心功能的有益作用;第二，本研究没有采用组织多普勒来评价左室舒张功能，因为很难获得所有实验兔的心尖切面。

总之，在心肌梗死模型中，藻酸盐水凝胶可作为生长因子的投递系统并填充梗死区提供梗死心肌组织的物理支撑。我们的研究表明无针喷射控释双生长因子藻酸盐水凝胶能够增加瘢痕厚度，改善左室重塑。生长因子VEGF-A165和PDGFBB的顺序投递能够增加微血管密度，并诱导成熟小动脉的形成，从而改善心功能，为缺血性心脏病的治疗提供一种新方法。

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