厄洛替尼对人胰腺癌细胞凋亡及survivin蛋白表达的影响

王 原 陈 红 房 芳 杨照环 王海波 刘华群

(河北联合大学附属医院消化科，河北 唐山 063000)

胰腺癌早期症状隐匿，超过70%的胰腺癌患者确诊时已是中晚期，易发生转移，预后恶劣〔1〕。有报道胰腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)的阳性率接近50%，参与了胰腺癌的发生、发展和转移。厄洛替尼为人表皮生长因子受体(HER1/EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，广泛应用于治疗胰腺癌的基础和临床研究。本研究从细胞水平进一步观察厄洛替尼对胰腺癌细胞增殖抑制、促进凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞株PANC-1购自中国科学院上海细胞生物学研究所。噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma-aldrich公司。RAD001用二甲基亚砜(DMSO)配制成1 mmol/L贮备液，实验时用RPMI1640培养液稀释至实验所需浓度。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒KGA107购于南京凯基生物科技发展有限公司，山羊抗兔SP免疫组化染色试剂盒SP-9001购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人survivin sc-10811多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2 MTT比色法检测细胞增殖变化 调节PANC-1细胞浓度，以3×103/孔接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 ml，37℃孵育4 h，轻轻吸弃培养液，每孔加入150 ml DMSO，振荡10 min选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(OD)值，计算各组细胞抑制率=〔(空白对照组OD值－各实验组OD值)/空白对照组OD值〕×100%。

1.3 胰腺癌PANC-1细胞凋亡的检测 收集厄洛替尼作用24、48、72 h及空白对照组的细胞，调整细胞密度为1×107个/ml，取 25 μl的细胞悬液与 1 μl的 AO/EB 染液混匀。吸取上述10 μl的混合液置于一洁净的载玻片上，盖玻片封片后置于荧光显微镜下观察。

1.4 survivin蛋白的表达情况 Western印迹检测胰腺癌PANC-1细胞中survivin蛋白的表达情况。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行分析，所有实验重复3次，结果数据用s表示，组间比较用两样本t检验。

2 结果

2.1 厄洛替尼对胰腺癌PANC-1细胞生长的抑制情况 MTT比色法结果显示:厄洛替尼能明显抑制胰腺癌PANC-1细胞的生长，随用药时间的延长和用药浓度的提高，抑制率明显增强(P＜0.05)。见图1。

图1 不同浓度、不同时间厄洛替尼对胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响

2.2 厄洛替尼对细胞凋亡的影响 12.5 μmol/L厄洛替尼作用24、48、72 h的PANC-1细胞凋亡率(%)分别为9.51±1.38，14.50±1.65，16.6±1.89。作用48 h后早期凋亡细胞开始减少，而晚期凋亡和坏死细胞上升，表明厄洛替尼通过早期诱导细胞凋亡继而导致细胞坏死。

2.3 Western印迹检测结果 与对照组比较，厄洛替尼作用48 h后胰腺癌PANC-1细胞中survivin蛋白表达不同程度下降(P＜0.05)。

3 讨论

肿瘤发生、发展和药物抵抗的发生机制与肿瘤细胞的凋亡相关〔2〕。因此，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤最常见的形式。厄洛替尼是一种小分子的TKI，主要通过与三磷酸腺苷竞争结合至EGFR胞内酪氨酸激酶功能域，抑制受体自磷酸化而阻止下游信号传导，从而抑制细胞周期进程，加速细胞凋亡，抑制血管生成，进而产生抗肿瘤作用〔3〕。

survivin高表达于绝大多数恶性肿瘤组织中，而在正常组织中不表达。研究表明，survivin的阳性高表达能抑制胃癌细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖〔4〕。Vaira等〔5〕将 mTOR下游底物p70S6K-cDNA转染入前列腺癌DU145细胞，发现了明显的survivin表达上调;而用小干扰RNA(siRNA)沉默内生p70S6K表达之后，出现survivin表达水平下降，说明survivin基因参与肿瘤的发生机制。本研究发现应用厄洛替尼处理后的胰腺癌PANC-1细胞增殖明显受到抑制，同时其survivin蛋白的表达也明显降低。分析其机制，由于survivin表达具有细胞周期依赖性，只在细胞周期的G2/M期表达，应用厄洛替尼后可使癌细胞阻滞于G1期，从而降低了survivin的表达水平，进而促进细胞凋亡。可以进一步推测，厄洛替尼通过下调survivin的表达，进而干扰胰腺癌的凋亡。同时，应用厄洛替尼竞争性结合EGFR，使EGFR对VEGF的调控能力降低，从而降低了VEGF导致的survivin的高表达。

厄洛替尼通过下调survivin蛋白的表达来诱导人胰腺癌细胞PANC-1凋亡。本研究不仅可以阐明厄洛替尼对胰腺癌凋亡的调控，同时从细胞水平为其抗肿瘤浸润提供了新的治疗思路和实验依据。

1 Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation〔J〕.Cell，2011;144(5):646-74.

2 崔 斐，陈 斌，陈锦章，等.凋亡抑制蛋白 Survivin和血管内皮生长因子在肝细胞癌中的表达及其临床意义〔J〕.南方医科大学学报，2008;28(5):761-3.

3 刘显红，马丽霞，张 爽，等.厄洛替尼治疗吉非替尼失败后晚期非小细胞肺癌的疗效〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(24):4790-1.

4 李凤朝，孔庆兖，杨雪梅.Survivin表达与胃癌细胞凋亡、增殖及肿瘤血管形成的关系〔J〕.实用癌症杂志，2004;19(6)592-4.

5 Vaira V，Lee CW，Goel HL，et al.Regulation of survivin expression by IGF-1/mTOR signaling〔J〕.Oncogene，2007;26(19):2678-84.