辛伐他汀对脓毒症大鼠心肌细胞核因子－κB、诱导型一氧化氮合酶表达的影响及意义

张立涛 李素彦 许 宁 赵鹤龄(河北省人民医院急诊科，河北 石家庄 05005)

脓毒症早期就已存在心肌器质性损伤，且发生率很高，其机制复杂，其中一氧化氮(NO)在脓毒症心肌损伤过程中发挥了重要作用。核因子(NF)-κB是一种广泛存在于体内细胞的核转录因子，NF-κB信号通路的过度活化与人类疾病的发生关系密切。脓毒症时NF-κB活性的增高调控iNOS的在心肌细胞中表达增加，可能是心肌损伤发生的机制之一。他汀类药物即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂是一种广泛应用的降脂药物，并可以减少患冠心病的风险。除此之外，他汀类药物尚有与降低血脂无关的多种生物作用，这种多效性包括:抗炎作用、免疫调节、抗氧化、抗凝血、稳定血管内皮等，脓毒症患者的功能异常往往就表现在以上几个方面，因此理论上他汀类药物可以改善脓毒症患者的预后。本实验，观察脓毒症模型大鼠心肌细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与NF-κB的表达，并评价辛伐他汀对二者表达的影响及意义，进一步探讨辛伐他汀的心脏保护性作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备 30只雌性Wistar大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供，体重250～270 g。采用盲肠结扎穿孔法(CLP)〔1〕建立脓毒症模型。麻醉前禁食8 h，以10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射麻醉后，将大鼠固定在实验台上。常规消毒腹部皮肤，于腹部皮肤正中做切口，长约2 cm，打开腹腔后小心分离盲肠，避免损伤肠系膜血管。盲肠如有粪便，则轻轻将其挤向与其相连的大肠，在盲肠与小肠及大肠交界处，用4-0号丝线环形结扎盲肠，避免结扎回肠和盲肠系膜血管。结扎完毕后仔细检查，保持肠道通路畅通。在与肠系膜相对的盲端肠壁浆膜面用18号针头穿刺三次，挤出适量肠内容物，并留置一宽约0.2 cm，长约3 cm橡皮引流条贯通盲肠，以防针孔闭合，轻轻将肠管放回原处，逐层缝合，关闭腹腔。

1.2 动物分组及处理 雌性Wistar大鼠30只，正常喂养，经1 w适应期后利用随机数字表分为正常组(N组)10只，造模组(CLP组)10只，辛伐他汀组(S组)10只。S组开始喂养辛伐他汀20 mg/kg(舒降之，默沙东，批号:国药准字H19990366)，用生理盐水配成等浓度药液灌胃(5 mg/ml)，每天1次，持续2 w。正常组和造模组用生理盐水灌胃(4 ml/kg)，每天1次，持续2 w。2 w后造模组及辛伐他汀组行盲肠结扎穿孔术，各组于术后48 h分别取大鼠左心室心肌组织，置入10%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋。

1.3 试验方法 iNOS一抗为兔抗大鼠IgG多克隆抗体，抗体稀释比例为1∶200。NF-κB p65一抗为小鼠抗大鼠IgG单克隆抗体，抗体稀释比例为1∶80。DAB显色，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3.1 标本HE染色 石蜡切片二甲苯脱蜡至水→苏木素染色5 min，流水冲洗数次→1%盐酸酒精分化20 s，1/400氨水返蓝，间以流水冲洗1 min→伊红染色5 min，流水冲洗30 s→梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片→光镜下读片。

1.3.2 S-P三步法免疫组织化学法染色 石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育15 min→蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min→盛有枸橼酸盐酸缓冲液的高压锅中进行高压抗原热修复10 min→3%H2O2室温孵育 5～10 min，PBS冲洗，2 min×3次→5% ～10%山羊血清封闭，室温孵育10 min，倾去血清，滴加一抗，37℃ 孵育2 h→PBS冲洗，2 min×3次→滴加1%BSAPBS稀释的生物素标记二抗，37℃ 孵育10～30 min→PBS冲洗，2 min×3次→滴加PBS稀释的辣根酶标记链霉卵蛋白素，37℃ 孵育15 min→PBS冲洗，2 min×3次→DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，脱水透明、封片。

1.3.3 染色结果的判定 iNOS阳性染色为在细胞质内出现黄色或棕黄色颗粒沉着。NF-κB p65阳性染色为在细胞质(部分在细胞核)内出现黄色或棕黄色颗粒沉着。阳性细胞必须具备:①细胞结构清晰;②阳性颗粒定位、定性好;③着色明显高于背景。评分标准:参照Soslow〔2〕的评分方法，应用美国多功能真彩色细胞图像分析管理系统分析:每张切片随机取5个(×200)高倍视野，采用阳性细胞显色强度和阳性细胞百分比双重判定进行评分，并将二者评分乘积作为最终评分进行统计学分析。

1.4 统计学方法 使用SAS8.0统计软件分析。等级资料采用多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验及两独立样本比较的Wilcoxon秩和检验。

2 结果

2.1 大鼠的一般情况 CLP组大鼠术后表现出无活力，反应差，发绀，立毛和呼吸急促的特点。打开腹腔后可见血性腹水，可闻及恶臭味，并发现部分大鼠肠管水肿，盲肠发黑，可见脓苔。相比之下，S组大鼠表现相对较轻。

2.2 HE染色结果 N组大鼠心肌纤维结构正常。CLP组大鼠心肌纤维水肿，疏松，间质充血水肿，部分可见淀粉样变性。心内膜内皮细胞部分肿胀，局部脱落，缺损。而S组心肌的组织病理学改变相比CLP组较轻，见图1。

2.3 免疫组织化学染色结果

2.3.1 iNOS的表达 N组大鼠心肌细胞iNOS蛋白表达微量。CLP组大鼠心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色或棕色颗粒沉着，与N组相比明显增加(P＜0.05)。S组大鼠心肌细胞胞质内棕黄色颗粒与CLP组相比明显减少并有统计学意义(P＜0.05)，与N组相比无明显差异(P＞0.05)。见图2，表1。

2.3.2 NF-κB的表达 N组大鼠心肌细胞NF-κB蛋白表达微量。CLP组大鼠心肌细胞胞浆内可见棕黄色或黄色颗粒沉着，部分细胞核黄染，与N组相比明显增加(P＜0.05)。S组大鼠心肌细胞胞浆内棕黄色颗粒与CLP组相比明显减少并有统计学意义(P＜0.05)，与 N组相比无明显差异(P＞0.05)。见图3，表2。

表1 各组大鼠心肌组织iNOS(n，n=10)

表2 各组大鼠心肌组织NF-κB表达(n，n=10)

图1 各组大鼠心肌组织病理学点(HE，×200)

图2 各组心肌组织iNOS表达(DAB，×200)

图3 各组大鼠心肌组织NF-κB表达(DAB，×200)

3 讨论

3.1 脓毒症模型的建立 建立标准化的脓毒症动物模型是探索脓毒症病理生理学机制和防治措施的重要环节，在脓毒症研究领域具有举足轻重的作用。脓毒症动物模型目前常用的有内毒素诱导、细菌注射、腹膜炎模型即盲肠结扎穿孔模型等方法。用CLP方法造模，炎症部位是否被大网膜包裹关系到脓毒症动物模型的成功与否，并与实验者手术方法(如穿孔大小、盲肠结扎程度)和动物的种系、年龄、性别有关，人为控制存在一定困难，但是该模型操作起来相对简便，通过外科手术而引起腹腔感染，与临床上化脓性阑尾炎穿孔形成的腹膜炎相似。本实验采用CLP法复制大鼠脓毒症模型，使有菌的肠内容物污染腹腔造成弥漫性腹膜炎，诱发广泛的全身性炎性反应。根据术后大鼠的表现及处死后解剖所见，符合脓毒症动物模型的基本要求〔3〕，因此，利用此模型进行研究更具说服力，更贴近临床。

3.2 脓毒症时心功能异常的特征与机制 Waisbren等〔4〕最早在临床发现由于脓毒症所导致的心脏功能异常的现象，虽然脓毒症患者心输出量大致正常，但是每搏量和射血分数明显降低〔5〕，一旦脓毒症患者出现心脏功能异常，其死亡率会明显增加。Natanson等〔6〕对犬脓毒症模型的研究发现脓毒症时其心脏的收缩与舒张功能都受到明显抑制。目前，大量临床〔7，8〕与基础〔9〕研究证明，心肌收缩力的降低与顺应性的下降是脓毒症时心脏功能异常的主要原因。虽然右心室与左心室在结构及功能上有一定的差异，但在脓毒症过程中其功能障碍与左心室表现基本相似〔10〕。虽然关于脓毒症时心脏功能异常机制的研究取得巨大进展，但其确切机制至今仍不明确，这其中涉及多种因素，包括:心肌抑制物、细胞因子、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)和前列腺素类物质的作用等，其中大量研究发现高水平的NO可以抑制心肌收缩功能。

NO在心血管系统内发挥着复杂的生物学效应。其可以在不同的生理和病理生理条件下调整心脏的功能。许多实验表明高剂量的NO对心肌收缩功能具有抑制作用。Brady等〔11〕研究发现给豚鼠腹腔注射内毒素，4 h后取出心脏，测定心室肌细胞的收缩性，发现心肌细胞收缩力明显下降。这种作用可被一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L精氨酸甲酯(L-NAME)所逆转，提示内毒素激活NOS可产生NO，而抑制心肌收缩力。另外作者〔12〕给正常的豚鼠离体心室肌细胞直接应用NO及NO供体硝普钠，也出现了心肌细胞收缩功能的减退，直接证明了NO对心肌收缩功能的抑制作用，并认为这与NO影响心肌细胞环鸟苷酸的产生有关。Kelm等〔13〕则证实高剂量的NO对心肌收缩力的影响与其抑制心肌细胞能量产生有关。

NO是在NOS催化左旋精氨酸转变为左旋瓜氨酸的过程中合成的。NOS有三个亚型，包括神经型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)。iNOS在体内分布较广，已证实心肌组织中许多成分如心肌细胞、心脏微血管的内皮细胞、平滑肌细胞以及心内膜内皮细胞都有分布。Wagner等〔14〕发现 iNOS可以在细胞因子如 IL-1β、TNFα、IFNγ、IL-6 等的刺激下经由细胞内NF-κB系统与信号转导因子和转录激活因子(STAT)信号转导通路调控合成，并产生大量NO。本实验通过应用免疫组化的方法对脓毒症大鼠心肌细胞的研究发现:造模后48 h，心肌细胞的NF-κB和iNOS的蛋白表达明显增加，因此认为与CLP后炎症因子激活NF-κB系统使iNOS表达增加有关，并因此造成模型大鼠心肌细胞受损。

3.3 他汀类药物抗脓毒症作用 他汀类药物抗脓毒症作用机制较为复杂，同时也是多方面的，包括抗炎、抗凝血、调节细胞免疫、改善内皮细胞功能、抗氧化应激反应等效应。Merx等〔15〕采用CLP法复制小鼠脓毒症模型，结果表明，经过他汀类药物预处理的小鼠平均存活率是对照组的4倍。Chaudhry等〔16〕发现西立伐他汀可以明显降低由脂多糖所诱导的小鼠促炎因子TNF-α和IL-6的释放，加快细菌清除，提高小鼠的生存率。他汀类药物同时可以改善脓毒症时肾脏〔17〕和心脏功能〔18〕。

Huang等〔19〕在对LPS和IFN-γ刺激后的小鼠巨噬细胞的研究发现，洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀可以抑制巨噬细胞iNOS的表达，并认为这与他汀类药物可以抑制NF-κB活性和STAT-1磷酸化有关。Wagner等〔14〕对细胞因子刺激后的大鼠胸主动脉内皮细胞的研究发现，阿托伐他汀可以减弱内皮细胞NF-κB和STAT-1的核转运，使iNOS的表达减少。Madonna等〔20〕对经TNF-α和IL-1刺激后的大鼠心脏胚胎细胞的研究发现，辛伐他汀可以提高NF-κB的抑制物IκB水平，并减少其细胞核内NF-κB含量，因此减少iNOS mRNA及iNOS蛋白的表达。本实验中经辛伐他汀预处理的大鼠在造模后48 h，心肌细胞的NF-κB和iNOS的蛋白表达较造模组明显减少，考虑与辛伐他汀抑制NF-κB的活性，进而降低iNOS在心肌细胞的表达有关，因此理论上20 mg/kg辛伐他汀可以减少脓毒症大鼠心肌细胞NO的产生，起到心肌保护性作用。

本研究主要通过免疫组化的方法研究辛伐他汀对脓毒症大鼠的心肌保护性作用，受研究方法与样本数所限，结果存在一定局限性。同时20 mg/kg的辛伐他汀的剂量只是参考相关文献进行的探索性实验，因此其他剂量与种类的他汀类药物的实验效果有待进一步研究。

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