α3神经型尼古丁乙酰胆碱能受体在阿尔茨海默病中的抗炎作用

廖 媛 齐晓岚 官志忠 (成都市第六人民医院病理科，四川 成都 60000)

阿尔茨海默病(AD)脑组织中典型神经病理改变是老年斑(SP)和神经原纤维缠结(NFTs)形成及神经元丢失等〔1〕。AD早期就有胆碱能缺失的症状，如果增加脑内乙酰胆碱(Ach)递质水平，记忆功能就得以改善。有研究证明，Ach能影响炎性因子，迷走神经的激活能抑制巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF)，从而达到减少炎性反应，这就是Ach抗炎机制的假说〔2〕，称之为“胆碱能抗炎通路”(CAP)。Wang等〔3〕研究指出当迷走神经受到刺激后释放的胆碱能神经递质Ach与巨噬细胞α7尼古丁型乙酰胆碱受体(nAChR)受体结合后，抑制巨噬细胞炎性介质的合成与分泌，削弱外周炎性反应。nAChRs激活对炎性介质表达的基因调控机制尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Aβ1～42购自Sigma公司;兔抗 NF-κBp65多克隆抗体购自Santa Cruz公司;兔抗MCP-1单克隆抗体;兔抗MIP-1α单克隆抗体购自武汉博士德公司;兔抗TNF-α单克隆抗体购自北京中杉公司;二抗购买公司与一抗相同。ELISA试剂盒购于上海活乐公司;胎牛血清、DMEM培养基购自HyClone公司。实时荧光定量PCR反应Power SYBR Green PCR Master Mix购自Applied Biosystems公司。MTT购自Sigma公司。

1.2 研究对象 人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞培养及分组:选择SH-SY5Y细胞株(德国 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司)及本课题组保存的SH-SY5Y α3 nAChR siRNA细胞株;用含10%胎牛血清、双抗(青霉素25 U/ml和链霉素25 U/ml)的DMEM作为培养液，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中孵育;待细胞生长稳定后，改用不含血清的DMEM培养液继续培养12 h。用聚合后(37℃孵育3 d)的 Aβ1～42(1 μmol/L)处理培养细胞，然后分别培养 48 h;对照组不加Aβ处理。

1.3 MTT比色法 向96孔细胞培养板中，加入一定数量(约1×104/孔)SH-SY5Y细胞，体积为150 μl/孔，培养使其贴壁生长。细胞生长稳定后，改用不含血清的DMEM培养液继续培养12 h，分对照组(不加任何处理)和不同浓度 Aβ1～42处理组(0.01、0.1、1、2 及 5 μmol/L)，对照组和各浓度处理组均设复孔6个，处理细胞48 h(Aβ1～42预先用 DMSO稀释，37℃孵育3 d后使用)，加入5 mg/ml MTT试剂，代谢4 h，小心吸弃上清液，加入细胞溶解液100 L/孔DMSO使细胞充分溶解。酶标仪570 nm波长测定吸光度。

1.4 Western印迹 用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒提取细胞核蛋白。细胞核蛋白，BCA定量，－70℃冻存。Western印迹方法检测各组细胞 NF-κBp65蛋白表达。以Bandscan软件分析结果时以β-actin蛋白条带作为内参照，计算NF-κBp65蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为蛋白质表达的相对水平比。

1.5 ELISA 收集Aβ1～42处理各孔细胞培养基用ELISA试剂盒检测各组细胞培养基内 MCP-1、MIP-1α、TNF-α表达情况。ELISA分析结果时以标准曲线作为内参照，计算 MCP-1、MIP-1α、TNF-α胞外分泌浓度(ng/L)作为蛋白质表达的相对水平。

1.6 Trizol一步法提取各组细胞总RNA 取出处理好的细胞，在6孔板内加1 ml Trizol，剧烈震荡混匀，静置5 min，将细胞裂解液转移转移到DEPC水预处理的1.5 ml离心管，加氯仿 200 μl，轻摇 5 min，室温静置 2～3 min后，4℃12 000 r/min离心5 min，RNA样品的纯度、浓度和完整性鉴定，以总RNA为模板反转录合成cDNA。实时定量PCR方法检测各组细胞 NF-κBp65、MCP-1、MIP-1α、TNF-α mRNA 表达。实时定量 PCR结果以cDNA产物为模板进行实时定量PCR，采用SybrGreen法测定。ABI step one plus型荧光定量PCR仪采集待测基因及内参照β-actin扩增个循环荧光信号，以Applied Biosystems Step v 2.1软件进行荧光采集和数据分析。分析其△△Ct值及RQ值，RQ=2－△△Ct。以β-actin为内对照，计算 NF-κBp65、MCP-1、MIP-1α、TNF-α mRNA 和对照组的相对水平。引物序列见表1。

1.7 统计学方法 使用SPSS11.5统计软件，结果用s表示，组间差异用t检验方法。

表1 实时定量PCR引物序列及PCR产物片段

2 结果

2.1 Aβ1～42处理 SH-SY5Y细胞存活率 0.1 mol/L浓度的Aβ1～42处理 SH-SY5Y细胞 48 h可见 MTT还原率降低，表明Aβ1～42能明显影响细胞增殖能力，具有一定的神经毒性作用，并呈现剂量依赖性负性相关关系。本研究选择1 μmol/L浓度Aβ1～42处理细胞。0.01、0.1、1、2.5 μmol/L Aβ1～42处理 SHSY5Y细胞48 h MTT还原率分别为98.2%、89.8%、80.2%、58.7%、38.8%。

2.2 尼古丁受体基因siRNA后3尼古丁受体mRNA及蛋白表达水平 据前期实验表明，用实时定量RT-PCR和Western印迹方法检测到SH-SY5Y细胞转染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo质粒后mRNA及蛋白表达水平分别下98%及66%。转染阴性对照siRNA不影响细胞α3尼古丁受体表达水平。

2.3 SH-SY5Y α3-nAChR siRNA 细胞株 NF-κBp65 核蛋白表达情况 与对照组相比较，Aβ1～42处理组、α3nAChR siRNA处理组SH-SY5Y细胞NF-κBp65核蛋白表达均增加(P＜0.05)。

2.4 SH-SY5Y α3nAChR siRNA 细胞株 MCP-1、MIP-1α、TNF-α蛋白表达情况 与对照组相比较，Aβ1～42处理组、α3nAChR siRNA处理组SH-SY5Y细胞MCP-1蛋白表达分别增加31%(P＜0.05)和3%。MIP-1α蛋白表达分别增加102%和92%(P＜0.05)。TNF-α蛋白表达分别增加88%和97%(P＜0.05)。。

2.5 SH-SY5Y α3nAChR siRNA 细胞株 NF-κBp65、MCP-1、MIP-1α、TNF-α mRNA 表达情况 与对照组相比较，Aβ1～42处理组、α3nAChR siRNA处理组SH-SY5Y细胞NF-κBp65 mRNA表达分别增加25%和80%(P＜0.05)。MCP-1 mRNA表达分别增加41%(P＜0.05)和10%。MIP-1α mRNA表达分别增加102%和67%(P＜0.05)。TNF-α mRNA表达分别增加78%和131%(P＜0.05)。

3 讨论

研究显示，AD脑中最明显和严重的改变在胆碱能系统，表现为海马和大脑皮层胆碱能神经元的缺失和功能异常，脑内ACh浓度降低，脑脊液和脑组织中胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯(AChE)活性降低，Ach合成、释放、摄取功能下降，以及胆碱能受体数目减少等〔4〕。胆碱能受体最初根据其对天然生物碱毒蕈碱和尼古丁的药理反应性分为毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)和尼古丁型乙酰胆碱受体(nAChR)。nAChRs在大脑的学习记忆、注意力的保持以及其他神经递质释放的调节和神经保护功能等方面起着非常重要作用〔5〕，此外 nAChRs还具有明显的神经保护作用〔6，7〕。

CAP通过抑制促炎细胞因子的合成反馈地监控和调节炎症反应〔8〕。运用其反义寡核苷酸抑制α7亚单位以及基因敲除而缺失α7亚单位的研究中显示出N型ACh受体α7亚单位是胆碱能抗炎通路的一个必需的组成部分。进一步在α7尼古丁受体基因敲除的小鼠和野生对照小鼠相比较，用相同剂量的内毒素诱导内毒素血症，α7尼古丁受体基因敲除的小鼠血清中和肝脏等组织中炎性介质的水平显著高于野生对照小鼠，而且电刺激野生型小鼠的迷走神经能够显著降低其血清和组织中炎症因子的水平，但在α7尼古丁基因敲除的小鼠，迷走神经刺激对炎症介质的水平则没有影响。Madden等〔9〕首次报道发现脑单核巨噬细胞-小神经胶质细胞上存在含有α7亚单位的N型受体，体外实验中ACh和烟碱预处理能抑制内毒素引起的小神经胶质细胞释放TNF。这一作用可被亚单位拮抗剂所抑制。此研究结果提示中枢可能也存在与外周相似的胆碱能抗炎通路。Calogero等〔10〕报道在神经细胞和非神经细胞，α7受体激动剂经Jak2(Jak2)和PI3K(PI3K)触发蛋白激酶B(PKB)的磷酸化。研究证明，α7受体激动剂主要通过两条信号通路:Jak/STAT(Janus激酶信号/转导子和转录激活子)信号通路NF-κB信号通路。Bustin等〔11〕研究表明在不同细胞类型包括单核细胞、巨噬细胞及内皮细胞，α7受体激动剂的抗炎作用是通过抑制转录因子NF-κB来实现的。本实验结果为nAChRs的抗炎作用提供了佐证。

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