绵羊肺腺瘤病毒env基因致瘤机制

孔汉金，张克山，刘永杰，尚佑军，刘湘涛

绵羊肺腺瘤（sheep pulmonary adenomatosis，SPA）是由外源性D型和B型绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）引起一种慢性、进行性、接触性传染的肺脏肿瘤性疾病，临床表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦和大量浆液性鼻漏，病理变化表现为Ⅱ型肺泡上皮细胞和无纤毛细支气管上皮细胞肿瘤性增生[1]。世界动物卫生组织将其列为B类传染病，1825年南非首次报道此病。目前除澳大利亚、新西兰未见该病报道以及冰岛已用严格措施灭绝了该病外，世界上多数养羊业发达国家和地区都有该病的发生和流行，该病死亡率近100%。因此SPA的发生和流行会对养羊业造成重大的经济损失。

JSRV基因组为线性单股正链RNA，属于逆转录病毒科，β反转录病毒属。JSRV主要侵害肺泡Ⅱ型细胞和克拉拉细胞引起细胞瘤性转化，形成上皮肿瘤。病毒进入细胞后，在自身编码的反转录酶作用下形成前体DNA，并在病毒基因组两端附加相同的长末端重复序列（Long terminal Repeat，LTR），随后整合到宿主细胞基因组中，以前病毒DNA的形式暂时或长期存在于宿主细胞染色体中。SPA与人细支气管－肺泡癌（bronchiolo－alveolar carcinoma，B A C）有着相似的临床症状、病理组织学特征及超微病理变化，因此SPA可为研究人类BAC提供理想的动物模型。JSRV env基因编码病毒囊膜蛋白，具有潜在的致瘤作用，对env基因致瘤的分子机制的研究一直是JSRV研究领域的焦点。本文重点对JSRV编码的env基因致瘤机制作一概述。

1 逆转录病毒致瘤机制

人们首次发现能致瘤的逆转录病毒是禽白血病病毒和劳斯氏肉瘤病毒，如今已在多种动物中发现致癌性逆转录病毒。根据诱导疾病的快慢和转化机制的不同，致癌逆转录病毒分为急性转化逆转录病毒和非急性转化逆转录病毒。

急性转化逆转录病毒诱发疾病快速，能够在多种动物中诱发多发部位的恶性肿瘤，该类病毒具有致癌性是因为病毒能够直接捕获宿主细胞的原癌基因[2]，表达能激活细胞生长通路的突变蛋白，从而诱发肿瘤。

非急性转化逆转录病毒致病有很长的潜伏期，不能转化体外培养的细胞，通过插入激活方式诱导肿瘤形成。前病毒随机整合到宿主基因组的多个位点，如果前病毒整合插入原癌基因附近，病毒的启动子和增强子就会启动原癌基因过表达，最终导致肿瘤的形成[3]。因为前病毒整合插入到原癌基因附近的概率较低，所以非急性转化逆转录病毒诱导肿瘤形成需要很长的时间。癌基因捕获和原癌基因的插入激活是逆转录病毒诱导肿瘤形成的两个主要的机制。

2 JSRV编码的env基因特征

JSRV env蛋白为含有615个氨基酸的膜蛋白，经细胞蛋白酶裂解为N－端表面蛋白（SU）和C－端跨膜结构域（TM）两部分，两者以二硫键连接。同其他逆转录病毒一样，JSRV env的TM区含有44个氨基酸长度的内部尾区位于胞质内称为胞质尾，SU蛋白位于胞质外通过TM区固定在质膜上。JSRV env的SU蛋白参与细胞受体结合，而锚定SU蛋白的TM区介导病毒与宿主细胞膜的融合。env蛋白的胞质尾部包含YXXM基序，如果酪氨酸（Y）磷酸化，该基序可作为PI3K／p85调节亚基的结合位点[4]。涉及YXXM基序和其他env蛋白质区域的JSRV转化细胞的分子机制目前已得到了深入研究。

3 JSRV env是致癌基因

NIH 3T3是一种对致癌基因引起细胞转化很敏感的接触抑制性成纤维细胞，常被用于检测病毒致癌基因和细胞原癌基因的存在。研究者通过用CMV启动子替换JSRV基因组5′端LTR构建了pCMV－JSRV21传染性克隆转染小鼠NIH 3T3细胞导致转化病灶的出现，表明JSRV基因组中携带引起NIH 3T3细胞转化潜能的致癌基因，对该感染性克隆分别去除 ORF－X、gag、pol、env等基因后观察对细胞转化的影响，结果表明只有env基因存在才能引起NIH 3T3细胞转化，是诱导细胞转化的必须基因[5]。

4 JSRV env基因的转化活性区域

JSRV env基因具有转化体外培养细胞和体内诱导肿瘤发生的能力表明JSRV是一种急性转化逆转录病毒[5]。和其他急性转化逆转录病毒相比，JSRV基因组中没有宿主细胞衍生的癌基因，但其编码的env蛋白具有转化潜能。动物鼻内肿瘤病毒（ENTV），禽血管瘤病毒（AHV），形成脾脏病灶病毒（SFFV）的env蛋白也显示该方面的潜能[6]。

JSRV env蛋白能够体外转化多种细胞系，包括NIH 3T3小鼠成纤维细胞，208F大鼠成纤维细胞，Rat6肺间质成纤维细胞，DF－1禽流感胚胎成纤维细胞，MDCK上皮细胞，鼠肾上皮（RK3E）细胞以及人支气管BEAS－2B上皮细胞等。缺失和突变实验表明env蛋白TM区的胞质尾部对转化至关重要[7]。JSRV各毒株间的TM区胞质尾的YXXM基序高度保守，但是无转化特性的内源性绵羊肺腺瘤病毒（en－JSRV）的env蛋白无此基序[8]。若将酪氨酸（Y）残基定点诱变成苯丙氨酸或天冬氨酸，JSRV env将失去在NIH 3T3细胞和其他细胞系的转化特性[9]。JSRV env胞质尾能被PI3K识别，启动涉及Akt和下游细胞信号通路的一系列激活[10]，从而引起细胞转化。PI3K和Akt被认为是逆转录病毒致癌基因的作用底物，PI3K抑制剂会抑制JSRV转化细胞的能力[11]。

JSRV env其他区域对于引起细胞转化也十分重要。SU表面蛋白的变异能使JSRV env丧失在NIH 3T3和208F纤维细胞的转化能力[9]。研究发现由enJSRV和exJSRV构建的env蛋白嵌合体，即保留exJSRV的TM胞质尾区，而整个SU蛋白和TM的胞外跨膜区以enJSRV相对应的序列代替，不能转化NIH 3T3细胞[12]。JSRV env蛋白诱导细胞转化时，其SU区功能独立于TM区。SU蛋白缺失突变体与TM蛋白突变体共转染208F纤维细胞引起细胞转化表明两者间存在互补转换。Da－nilkovitch[13]等通过研究 BEAS－2B人类支气管上皮细胞阐明了JSRV env蛋白的SU区参与细胞转化的机制。BEAS－2B细胞上含有SU蛋白受体Hyal2，能与Stk／RON生长因子受体结合，Hyal2－RON复合体具有低Ron激酶活性。当JSRV env蛋白与Hyal2结合促使RON游离，游离的RON导致激酶活性的增加，从而激活了细胞内PI3K／Akt和MAPK信号通路。SU蛋白也可以不依赖Hyal2／RON复合体影响着JSRV的转化，JSRV SU蛋白不能结合Hyal2鼠同源物，但JSRV env仍可以转化啮齿动物的纤维细胞，而且鼠Hyal2的过表达对JSRV env转化NIH 3T3和208F细胞的强弱影响不大[14]。因此JSRV env高效转化细胞的机制是SU区传输转化的独立信号，并且与TM区触发的信号连在一起联合作用，导致细胞转化的发生。

5 JSRV env诱导转化的信号通路

通过研究转化过程中特定抑制剂对信号级联途径中的激活蛋白的影响以及 Western－bloting和免疫组化方法验证，揭示了参与JSRV转化或肿瘤发生过程中的信号传导通路。现已报道JSRV env涉及的细胞转化主要有3种信号通路。

5.1 PI3K－Akt－mTor信号通路 该信号通路作为细胞增殖、生存、致瘤转化和癌症发展的决定因素而著名。它可被多种因素激活，如生长因子、激素、细胞因子以及酪氨酸激酶受体或非酪氨酸激酶受体的突变或超表达。下游AKt激酶的激活（磷酸化）可依赖或不依赖PI3K。依赖PI3K的Akt信号通路的激活首先需要启动细胞膜PI3K的募集，通过SH2区域结合p85亚基到酪氨酸－磷酸化受体酪氨酸激酶上。膜结合PI3K分解磷脂酰肌醇（4，5）磷酸盐产生磷脂酰肌醇（3，4，5）三磷酸酯（PIP3）。随后PIP3依次招募磷脂酰肌醇依赖激酶1（PDK1）和AKt到细胞膜上促使PDK1激活AKt。不依赖PI3K的Akt激活信号通路可能是第二信使cAMP通过钙／钙调蛋白依赖激酶（CaMKK）触发AKt的磷酸化[15]。激活的AKt能够磷酸化许多诸如控制细胞增殖的底物。图5显示了一种哺乳类动物重要细胞生长调节因子RPM靶蛋白（Mtor）激活的信号通路。

在JSRV env转化的其他细胞系和诱发的SPA肿瘤中可观察到AKt如上所述的组成性激活[16]。研究发现用PI3K抑制剂LY294002处理后，SPA病例的II型肺泡细胞中Akt磷酸化大大减少[17]，表明这些细胞中发生了PI3K依赖的AKt激活。但用PI3K－Akt刺激因子EGF却不能引起这些细胞出现明显的反应，表明JSRV感染后PI3K－Akt信号通路调节发生了异常。YXXM基序对于JSRV诱导细胞转化非常重要，但是该基序并不直接结合并激活PI3K。JSRV env胞质尾的YXXM基序中酪氨酸残基突变使JSRV env的转化活性有所降低，但不能导致JSRV在一些细胞系内完全阻止Akt磷酸化而丧失转化特性。因此，JSRV env可能通过其他未知细胞适配器分子或触发其他的信号通路（图5）间接地激活PI3K／Akt通路。同时JSRV可以引起PI3Kp85亚基缺陷的NIH 3T3细胞转化表明PI3K对于JSRV的转化并不是必须的[10]，研究发现此种情况下AKt持续激活，JSRV env诱导细胞转化的关键是Akt持续活化而不是依赖PI3K[17]。mTOR抑制剂雷帕霉素能够部分抑制env转化效率，表明下游的Akt底物mTOR参与JSRV env 转化 NIH 3T3细胞[18]。

图1 JSRV env诱导细胞转化的信号通路[19]（引自Johnson C，2012）Fig.1 Signaling pathways involved in JSRV env－induced cell transformation[19]（Johnson C，2012）

5.2 Ras－Raf－MEK－MAPK 信号通路 JSRV env调解细胞转化的第2个信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径（图5）。该信号主要途径是Ras蛋白启动信号级联反应导致激活的MAPKs易位进入细胞核，引发涉及细胞分裂和增殖的转录因子磷酸化。主要有3个MAPK类型：细胞外信号调节激酶1和2（ERK1／2），压力激活蛋白激酶／c－Jun氨基终端激酶（SAPK／JNK）和 MAPK p38（图5）。首先活化的Ras蛋白刺激 MAPKK激酶（MAPKKK）Raf磷酸化，然后活化的Raf蛋白激活MAPK激酶（MAPKK）MEK1／2，接着磷酸化的MEK1／2又激活 MAPKs如ERK1／2，最终引起一系列的细胞信号反应。目前已证实Ras－Raf－MEKERK1／2信号途径在致瘤病毒引起的细胞转化中扮演了至关重要的角色[20]。

利用特定抑制剂抑制信号通路中的蛋白验证了JSRV env转化的MAPK信号途径。MEK1／2抑制剂PD98059与H／N－Ras抑制剂FTI－277在一定剂量下都能抑制JSRV env转化NIH 3T3细胞。但PD98059可强烈抑制JSRV env引起RK3E鼠肾上皮细胞转化，FTI－277只是部分抑制，这表明在RK3E鼠肾上皮细胞中可能有其他分子触发MEK1／2信号而不只是H／NRas[7]。后来实验和自然条件下诱导SPA肿瘤形成，免疫组化检测磷酸化ERK1／2阳性证实了以上猜测[21]。p38是MAPK信号通路的一个组成元件，用p38抑制剂SB203580处理细胞后增加了JSRV－env转化能力表明p38负调节JSRV env转化，原因可能是p38能减弱 MEK1／2与 ERK1／2间的信号传导[22]。

5.3 Hyal2／RON信号通路 JSRV env转化细胞的第3个信号通路可能是通过JSRV env受体Hayl2介导的信号传递途径（图5）。SFFV env蛋白能结合Stk／Ron受体启动RON／Hyal2途径导致受体介导下游因子的一系列激活。RON激酶失活突变能够阻断JSRV env引起BEAS－2B细胞转化表明RON／Hyal2途径对于JSRV env转化BEAS－2B细胞极其重要[13]。Hayl2介导的信号传递途径需要env与Hyal2结合，而JSRV env不能结合鼠源Hyal2和促进JSRV进入到小鼠细胞，而且RON的鼠系同源物Stk也不能在NIH 3T3细胞中表达，故此种信号通路可能不能解释JSRV env在啮齿动物细胞的转化。尽管如此，这种机制对于JSRV env介导绵羊II型肺泡细胞的转化非常重要，因为这些细胞具有功能性JSRV受体和表达RON蛋白。

5.4 其他信号通路 Rassa等报道小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）的env蛋白结合细胞Toll－like受体（TLR4）蛋白诱导细胞转化的可能机制，TLR4是一种涉及先天免疫的膜结合病原相关模式分子（PAMP）受体，与胞外配体结合后导致信号的级联放大，从而激活NF－κB转录因子和其他信号分子，MMTV env结合TLR4后能够刺激树突细胞和B淋巴细胞的大量增殖[23]。目前发现其他逆转录病毒的env蛋白也能与TLR4结合，包括鼠白血病病毒（MMLV）和JSRV[23]，由此推测JSRV env可能结合TLR4启动下游信号通路导致细胞的转化（图5）。尽管上述的几种信号通路已被确认是JSRV env激活转化细胞的可能机制，但是目前仍未完全弄清JSRV env怎样激活整个细胞的信号网络。

6 展 望

JSRV env基因在诱导体外细胞转化和SPA肿瘤发生中扮演着极其重要的角色，通过对JSRV env基因及表达产物的基本生化结构、转录调控、生物学功能的深入研究，从局部到整体上明确env基因在细胞转录和细胞信号转导中的作用，阐明绵羊肺腺瘤病毒致瘤机理提供可靠的理论依据。由于SPA病例是人细支气管－肺泡癌BAC唯一动物模型，因而通过揭示SPA的致瘤机制来探讨BAC的发病机理以及由此衍生效果更好的治疗方法其意义深远，已然成为人类医学和兽医交叉学科研究的热点。

[1]Yu DL，Linnerth－Petrik NM，Halbert CL，et al.Jaagsiekte sheep retrovirus and enzootic nasal tumor virus promoters drive gene expression in all airway epithelial cells of mice but only induce tumors in the alveolar region of the lungs[J].J Virol，2011，85（15）：7535－7545.DOI：10.1128／JVI.00400－11

[2]Walchner M，Leib－Mosch C，Messer G，et al.Endogenous retroviral sequences in the pathogenesis of systemic autoimmune disease[J].Arch Dermatol，1997，133（6）：767－771.DOI：10.1001／archderm.1997.03890420109015

[3]Fan H，Brightman BK，Belli B，et al.Early（preleukemic）events in Moloney murine leukemia virus leukemogenesis[J].Leukemia，1997，Suppl 3：149－151.

[4]Zhou S，Shoelson SE，Chaudhuri M，et al.SH2domains recognize specific phosphopeptide sequences[J].Cell，1993，72（5）：767－778.DOI：10.1016／0092－8674（93）90404－E

[5]Maeda N，Palmarini M，Murgia C，et al.Direct transformation of rodent fibroblasts by jaagsiekte sheep retrovirus DNA[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（8）：4449－4454.DOI：10.1073／pnas.071547598

[6]Alian A，Sela－Donenfeld D，Panet A，et al.Avian hemangioma retrovirus induces cell proliferation via the envelope（env）gene[J].Virology，2000，276（1）：161－168.DOI：10.1006／viro.2000.0550

[7]Hull S，Fan H.Mutational analysis of the cytoplasmic tail of Jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein[J].J Virol，2006，80（16）：8069－8080.DOI：10.1128／JVI.00013－06

[8]Palmarini M，Hallwirth C，York D，et al.Molecular cloning and functional analysis of three type D endogenous retroviruses of sheep reveal a different cell tropism from that of the highly related exogenous jaagsiekte sheep retrovirus[J].J Virol，2000，74（17）：8065－8076.DOI：10.1128／JVI.74.17.8065－8076.2000

[9]Hofacre A，Fan H.Multiple domains of the Jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein are required for transformation of rodent fibroblasts[J].J Virol，2004，78（19）：10479－10489.DOI：10.1128／JVI.78.19.10479－10489.2004

[10]Zavala G，Pretto C，Chow YH，et al.Relevance of Akt phosphorylation in cell transformation induced by Jaagsiekte sheep retrovirus[J].Virology，2003，312（1）：95－105.DOI：10.1016／S0042－6822（03）00205－8

[11]Maeda N，Fan H.Signal transduction pathways utilized by enzootic nasal tumor virus（ENTV－1）envelope protein in transformation of rat epithelial cells resemble those used by jaagsiekte sheep retrovirus[J].Virus Genes，2008，36（1）：147－155.DOI：10.1007／s11262－007－0193－x

[12]Palmarini M，Maeda N，Murgia C，et al.A phosphatidylinositol 3－kinase docking site in the cytoplasmic tail of the Jaagsiekte sheep retrovirus transmembrane protein is essential for envelope－induced transformation of NIH 3T3cells[J].J Virol，2001，75（22）：11002－11009.DOI：10.1128／JVI.75.22.11002－11009.2001

[13]Danilkovitch－Miagkova A，Duh FM，Kuzmin I，et al.Hyaluronidase 2negatively regulates RON receptor tyrosine kinase and mediates transformation of epithelial cells by jaagsiekte sheep retrovirus[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（8）：4580－4585.DOI：10.1073／pnas.0837136100

[14]Liu SL，Duh FM，Lerman MI，et al.Role of virus receptor Hyal2in oncogenic transformation of rodent fibroblasts by sheep betaretrovirus Env proteins[J].J Virol，2003，77（5）：2850－2858.DOI：10.1128／JVI.77.5.2850－2858.2003

[15]Filippa N，Sable CL，Filloux C，et al.Mechanism of protein kinase B activation by cyclic AMP－dependent protein kinase[J].Mol Cell Biol，1999，19（7）：4989－5000.

[16]Suau F，Cottin V，Archer F，et al.Telomerase activation in a model of lung adenocarcinoma[J].Eur Respir J，2006，27（6）：1175－1182.DOI：10.1183／09031936.06.00125105

[17]Maeda N，Inoshima Y，Fruman DA，et al.Transformation of mouse fibroblasts by Jaagsiekte sheep retrovirus envelope does not require phosphatidylinositol 3－kinase[J].J Virol，2003，77（18）：9951－9959.DOI：10.1128／JVI.77.18.9951－9959.2003

[18]Maeda N，Fu WX，Ortin A，et al.Roles of the Ras－MEK－mitogen－activated protein kinase and phosphatidylinositol 3－kinase－Akt－mTOR pathways in jaagsiekte sheep retrovirus－induced transformation of rodent fibroblast and epithelial cell lines[J].J Virol，2005，79（7）：4440－4450.DOI：10.1128／JVI.79.7.4440－4450.2005

[19]Johnson C，Fan H.Jaagsiekte sheep retrovirus and lung cancer[M].In：Robertson ES，CancerAssociatedViruses，Current Cancer Research.New York：Springer Science＋Business Media，LLC.2012：755－791.DOI：10.1007／978－1－4614－0016－5＿30

[20]Ballif BA，Blenis J.Molecular mechanisms mediating mammalian mitogen－activated protein kinase （MAPK）kinase （MEK）－MAPK cell survival signals[J].Cell Growth Differ，2001，12（8）：397－408.

[21]De las Heras M，Ortin A，Benito A，et al.In－situ demonstration of mitogen－activated protein kinase Erk 1／2signalling pathway in contagious respiratory tumours of sheep and goats[J].J Comp Pathol，2006，135（1）：1－10.DOI：10.1016／j.jcpa.2006.02.002

[22]Wada T，Penninger JM.Mitogen－activated protein kinases in apoptosis regulation[J].Oncogene，2004，23（16）：2838－2849.DOI：10.1038／sj.onc.1207556

[23]Burzyn D，Rassa JC，Kim D，et al.Toll－like receptor 4－dependent activation of dendritic cells by a retrovirus[J].J Virol，2004，78（2）：576－584.DOI：10.1128／JVI.78.2.576－584.2004