弓形虫ROP5基因与基因佐剂IL－12对小鼠免疫保护性

赵焕阁，林映莹，黄用豪，黄风迎，周松林，刘中娟，谭光宏，韦 祎

2.海南医学院干细胞研究所，海口 571101；

3.海南医学院中医学院，海口 571101

弓形虫是一种引起人兽共患病的细胞内寄生原虫，免疫功能正常的人感染弓形虫后无明显症状，而免疫功能不健全者和孕妇感染后造成的危害是及其严重[1]。特别是近年来随着器官移植者、恶性肿瘤患者及艾滋病患者数量的增多，弓形虫造成危害的趋势日益加重[2]。寻找一条积极有效的治疗弓形虫病的途径迫在眉睫。普遍认为，疫苗接种可能是防治弓形虫感染的最佳途径[3]，目前研究结果显示无论是单基因疫苗还是多基因疫苗均无法使实验动物一直存活下去，这就要求我们要从多角度展开研究，克服核酸疫苗免疫力低下的难题，力争能找到一条能有效防治弓形虫感染的途径。

细胞因子IL－12作为一种分子佐剂能够提高大多数疫苗的免疫原性，在弓形虫感染的过程中，IL－12的表达在其急慢性感染期均起到重要作用。弓形虫棒状体蛋白5（ROP5）属于ROP2家族，与ROP18蛋白具有较高的同源性。在小鼠模型中，ROP5蛋白的敲除将导致弓形虫强毒株的毒力丧失[4]，有良好的免疫原性和免疫保护性[5]。本研究选用小鼠白介素12（mIL－12）的真核表达质粒作为基因佐剂，来研究弓形虫ROP5基因与IL－12共免疫昆明小鼠所诱导的免疫保护性。

1 材料与方法

1.1 质粒和虫株 弓形虫RH株、大肠杆菌DH5α、重组质粒pcROP5和pcmIL－12均由本实验室构建。

1.2 实验动物 体重约20g，6w昆明种小鼠购自广东省医学院实验动物中心。

1.3 试剂 质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；HRP标记的抗小鼠IgG、IgG1和IgG2a、小鼠血清IL－4和IFN－γELISA kit、刀豆蛋白 A（ConA）购自武汉博士德生物。RPMI1640培养基购自Gibco公司；四甲基偶氮唑（MTT）购自北京拜耳迪生物公司。

1.4 重组质粒的大量提取与纯化 重组质粒过夜培养后，用质粒提取试剂盒按照说明书提取质粒并测OD值，使OD260／OD280位于1.8～2.0之间。重组质粒大量提取纯化后用生理盐水稀释到1μg／uL。

1.5 弓形虫裂解抗原的制备 将弓形虫RH株速殖子注入昆明小鼠腹腔内，至小鼠出现明显症状时收集虫体。收集的虫体－20。C反复冻融，冰浴中超声粉碎后离心，小心吸取上清液，紫外分光光度计测定蛋白浓度，－20。C保存备用。

1.6 重组质粒的免疫接种 64只昆明小鼠随机分成4组，每组16只。第1实验组小鼠注射重组质粒pcROP5，第2实验组小鼠共注射重组质粒pcROP5和pcmIL－12，第3组空质粒pcDNA3.1对照组，第4组空白对照组（PBS）。重组质粒大量提取纯化后用生理盐水稀释到1μg／μL，第1组昆明鼠肌肉注射重组质粒pcROP5100μg／只，第2组每只小鼠共肌注100μg重组质粒pcROP5和100μg重组质粒pcmIL－12，空质粒对照组和空白对照组以同样的剂量注射。每2w注射1次，共免疫3次。

1.7 免疫指标的测定

1.7.1 ELISA法对免疫小鼠IgG及其亚型IgG1和IgG2a的测定 于免疫前及每次免疫前一天和末次免疫后2w采取眼眶采血法收集小鼠血清，用间接ELISA法检测鼠血清中IgG及其亚型IgG1和IgG2a的表达水平。用弓形虫RH株速殖子裂解液抗原包被96孔酶标板4。C过夜，BSA37。C封闭2h，鼠血清1∶50稀释作为一抗，HRP标记的抗小鼠IgG，IgG1，IgG2a作为二抗1h后底物显色，终止反应后用酶标仪测定各孔吸收值。免疫鼠血清OD值／阴性对照OD≥2为阳性。

1.7.2 小鼠细胞因子IFN－γ、IL－4的测定 鼠血清用IFN－γ、IL－4检测试剂盒按说明书检测，根据标准品OD值绘制标准曲线，以此计算细胞因子IFN－γ、IL－4的含量。

1.7.3 淋巴细胞转化实验（MTT法） 无菌取脾，碾碎，过滤，制成单细胞悬液，Hanks清洗，用RPMI1640完全培养基调至细胞浓度1×106／mL，将1mL脾细胞加入到24孔板中，同时加ConA至终浓度为2.5μg／mL，每孔设不加ConA的对照，每个样本重复3次。在5%CO2培养箱37。C培养72h后，吸取每孔上清，标记保存。加1mL不含小牛血清的RPMI1640和10μlMTT继续培养4h，每孔加0.01mol／LHCL（含SDS），吹打混匀后，于分光光度计上测OD570nm值，计算淋巴细胞转化率：转化率﹦（OD值加ConA－OD不加ConA）／OD值加ConA×100%。

1.8 攻击感染实验 末次免疫3w后，将弓形虫RH株速殖子经复苏、分离，生理盐水稀释后，每鼠用1 000个弓形虫速殖子经腹腔注射进行攻击感染，观察小鼠生长状况及存活时间。

1.9 统计学分析 用SPSS软件对实验数据进行ANOVA分析或t检验分析。

2 结 果

2.1 免疫小鼠血清中特异性抗体IgG的检测 免疫3次后，用ELISA法检测各组小鼠血清中特异性抗体水平。间接ELISA法实验结果显示（图1），各实验组小鼠均能诱导产生特异性抗体，且均于3次免疫后4w达到最高值。实验组pcROP5，pcROP5＋pcmIL－12小鼠血清中特异性IgG水平与空载体对照组和生理盐水对照组相比差异显著 （P＜0.01），而空载体对照组和生理盐水对照组小鼠血清中特异性IgG水平差异不显著（P＞0.05）。实验组中，pcROP5＋pcmIL－12组的IgG水平明显高于pcROP5组（P＜0.05）。

图1 ELISA法检测免疫小鼠血清IgG抗体的结果Fig.1 Detection of serum IgG antibodies in the immunized mice by ELISA

2.2 免疫小鼠血清中IgG亚型的鉴定 末次免疫后4w各实验组小鼠血清均能诱导产生特异性IgG1和IgG2a抗体，IgG1抗体水平在各实验组之间变化不大；pcROP5＋pcmIL－12组IgG2a抗体水平明显高于pcROP5组和对照组（P＜0.05），对照组间差异不显著（P＞0.05）（图2）。

图2 ELISA法检测pcROP5和pcmIL－12共免疫对IgG亚型的影响Fig.2 Effect of pcROP5and pcmIL－12co－immunization on specific IgG isotypes

2.3 细胞因子含量的测定 采用ELISA法检测鼠血清中细胞因子IFN－γ，IL－4的含量，pcROP5组和pcROP5＋pcmIL－12组均能诱导T细胞分泌IFN－γ，与对照组相比差异显著（P＜0.01）。pcROP5＋pcmIL－12组鼠血清中IFN－γ明显高于pcROP5组（P＜0.05）。本试验中，各组间细胞因子IL－4的差异没有统计学上的意义，见表1。

表1 脾细胞培养上清中细胞因子IFN－γ和IL－4的水平Tab.1 Cytokines detected by ELISA in splenocyte cultures from immunized mice after stimulation with STAg

2.4 免疫小鼠抗原特异性淋巴细胞增殖实验 经ConA体外刺激诱导，所有组脾细胞均发生增殖。pcROP5＋pcmIL－12组淋巴细胞转化率为（53.81±1.98），pcROP5为（46.58±5.21），空载体对照组pcDNA3.1为（43.98±3.52），生理盐水对照组为（44.23±7.43）。pcROP5＋ pcmIL－12 组 与pcROP5组相比转化率有增高（P＜0.05），而两对照组间没有明显的差异。

2.5 弓形虫攻击感染后生存时间 4组小鼠均未能耐受弓形虫RH株速殖子腹腔攻击感染，攻击后第4d，空质粒对照组和空白对照组的小鼠开始出现精神状态不好，采食饮水减少等现象，而免疫组则在攻击后第7d出现此类现象。空质粒组小鼠的生存时间为（153.96±19.86）h，生理盐水组存活时间（145.68±31.62）h，pcROP5组小鼠存活时间为（192.15±9.37）h，pcROP5＋pcmIL－12组存活时间（247.96±10.61）h。pcROP5＋pcmIL－12组小鼠比pcROP5和对照组小鼠的存活时间有一定的延长（P＜0.05）。

3 讨 论

细胞因子IL－12是目前认为的作用免疫细胞范围最广、作用最强的细胞因子，在机体免疫功能中具有重要作用，尤其是对Thl／Th2平衡的影响备受关注[6]。将编码细胞因子IL－12的基因佐剂应用在其他寄生虫、病毒或细菌感染中也获得了较好的免疫效果，如利什曼原虫、艾滋病病毒、乙肝病毒、结核菌等[7－9]。近年来的研究表明，细胞因子在抗弓形虫感染免疫过程中，起着重要的调节作用。弓形虫的ROP5蛋白属于ROP2家族蛋白，与ROP18具有较高的同源性，是一类具有良好的免疫原性和保护性的蛋白[10－12]。为克服核酸疫苗免疫原性通常较低这一特点，本实验选用了细胞因子pcmIL－12作为基因佐剂，观察其对免疫效果是否有增强作用。

本实验结果显示pcROP5和pcmIL－12共免疫组小鼠较pcROP5单基因免疫组提高了鼠血清中IgG抗体的表达水平；共免疫组小鼠血清中IgG2a产量明显提高，IgG1表达水平无显著差异。细胞因子含量测定显示，共免疫组小鼠中IFN－γ的水平含量显著高于单独的ROP5基因免疫组小鼠，而IL－4细胞因子则无明显变化。淋巴细胞增殖实验也显示了共免疫组小鼠淋巴细胞增值率有所增加。弓形虫攻击感染后，尽管都未能存活，但共免疫组小鼠存活时间有了一定的延长。这些结果表明IL－12细胞因子与pcROP5质粒共注射可增强细胞的免疫反应，从另一角度为弓形虫疫苗的研制开发提供了重要的理论依据和实验基础。

[1]Saeij JP，Coller S，Boyle JP，et al.Toxoplasma co－opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue[J].Nature，2007，445 （7125）：324－327.DOI：10.1038／nature05395

[2]Rorman E，Zamir CS，Rilkis I，et al.Congenital toxoplasmosis prenatal aspects ofToxoplasmagondiiinfection[J].Reprod Toxicol，2006，21（4）：458－472.DOI：10.1016／j.reprotox.2005.10.006

[3]Bhopale GM.Development of a vaccine for toxoplasmosis：current status[J].Microbes Infect，2003，5（5）：457－462.DOI：10.1016／S1286－4579（03）00048－0

[4]Reese ML，Zeiner GM，Saeij JP，et al，Polymorphic family of injected pseudokinases is paramount inToxoplasmavirulence[J].PNAS，2011，108（23）：9625－9630.DOI：10.1073／pnas.1015980108

[5]Zhao HG，Wang H，Huang YH，et al.Construction of eukaryotic expression vector ofToxoplasmagondiiROP5gene and its immunoprotective effect[J].Chin J Zoonoses，2012，28（9）：947－950.DOI：10.3969／cjz.j.issn.1002－2694.2012.09.018 （in Chinese）赵焕阁，王华，黄用豪，等.弓形虫ROP5基因真核表达载体的构建及其免疫保护性的研究[J].中国人兽共患病学报，2012，28（9）：947－950.DOI：10.3969／cjz.j.issn.1002－2694.2012.09.018[6]McCluskie MJ，Davis HL.Novel strategies using DNA for the induction of mucosal immunity[J].Crit Revl Immunol，1999，19：303－329.

[7]Mohamed RM，Aosai F，Chen M，et al.Induction of protective immunity by DNA vaccination withToxoplasmagondiiHSP70，HSP30and SAG1genes[J].Vaccine，2003，21（21／22）：2852－2861.DOI：10.1016／S0264－410X （03）00157－9

[8]Saito S，Aosai F，Yano A，et al.Establishment of gene vaccinated skin grafting againstToxoplasmagondiiinfection in mice[J].Vaccine，2001，19（21－72）：2172－2180.DOI：10.1016／S0264－410X（00）00366－2

[9]Mevelec MN，Bout D，Desolme B，et al.Evaluation of protective effect of DNA vaccination with genes encoding antigens GRA4 and SAG1associated with GM－CSF plasmid against acute，chronical and congenital toxoplasamosis in mice[J].Vaccine，2005，23（36）：4489－4499.DOI：10.1016／j.vaccine.2005.02.025

[10]El Hajj H，Demey E，Poncet J，et al.The ROP2family ofToxoplasmagondiirhoptry proteins：Proteomic and genomic characterization and molecular modeling [J].Proteomics，2006，6：5773－5784.

[11]Yuan ZG，Zhang XX，He XH，et al.Protective Immunity induced byToxoplasmagondiirhoptry protein 16against toxoplasmosis in mice[J].Clin Vaccine Immunol，2011，18（1）：119－124.DOI：10.1128／CVI.00312－10

[12]Yuan ZG，Zhang XX，Liu RQ，et al.Protective effect against toxoplasmosis in mice induced by DNA immunization with gene encodingToxoplasmagondiiROP18[J].Vaccine，2011，29（38）：6614－6619.DOI：10.1016／j.vaccine.2011.06.110