青岛市售养殖海水虾中副溶血性弧菌的分离及耐药性分析

江艳华，姚 琳，李风铃，王联珠，宋春丽，翟毓秀

海水虾是我国重要的经济水产养殖动物之一，一些养殖户不规范使用或滥用抗生素，其结果造成养殖环境及产品中的细菌产生耐药性，食源性致病菌产生耐药性后进入人体，会对人类健康造成严重危害。副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）广泛存在于海产品中，在我国是引起食物中毒的最主要微生物病原[1]。特对青岛常见市售养殖海水虾中副溶血性弧菌进行分离，对分离菌株进行毒力基因检测和耐药性分析，了解其在海水虾产品中的污染和耐药状况。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 副溶血性弧菌标准菌株CGMCC 1.1615、CGMCC 1.1997，购于中国科学院普通菌种保藏中心。抗生素敏感试验质控标准菌株大肠杆菌ATCC 25922，购于美国菌种保藏中心（ATCC）。

1.2 培养基和试剂 3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）、硫代硫酸盐－柠檬酸盐－胆盐－蔗糖（TCBS）琼脂、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、3%氯化钠营养肉汤、M？H琼脂（使用时添加1%NaCl）等为中国陆桥生物技术有限公司生产；弧菌显色培养基为法国科玛嘉公司生产；细菌鉴定用GN卡为法国生物梅里埃公司生产；细菌基因组提取试剂盒和PCR扩增用试剂为大连宝生物工程有限公司生产；PCR扩增用引物见表1[2]，由上海生工生物工程有限公司合成；18种抗生素药敏纸片为英国OXOID公司生产。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.3 样品采集及菌株分离鉴定 2012年7月－2012年11月期间从青岛市南区和市北区主要大型农贸市场按随机采样原则采集养殖海水虾样品64份。样品处理及副溶血性弧菌的分离参照 GB／T 4789.7－2008部分进行[3]，可疑菌株采用全自动细菌鉴定仪（VITEK 2－compact，法国生物梅里埃）进行鉴定。

1.4 毒力基因检测 副溶血性弧菌分离株在3%氯化钠营养肉汤中36。C振荡培养过夜，离心，收集菌体，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。PCR反应体系（20μL）包括10×缓冲液，MgCl2（25mmol／L），dNTPs（10 mmol／L），正向引物和反向引物（20μmol／L），Taq酶1.0U，模板0.5μL。PCR反应条件为：94。C预变性5min，再按94。C变性60s，55。C退火45s，72。C延伸45s，进行30个循环，最后72。C延伸10min。所得扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统中检测。以副溶血性弧菌CGMCC 1.1615为tdh阳性对照，CGMCC 1.1997为trh阳性对照。

1.5 药敏试验 采用 WHO推荐的K－B法，药敏试验的质控和结果判定依据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）微生物敏感试验执行标准，以大肠杆菌ATCC 25922为质控菌株。

2 结 果

2.1 菌株的分离鉴定及毒力基因 通过全自动细菌鉴定仪对副溶血性弧菌可疑菌株进行确证。采集的64份样品中50份检出副溶血性弧菌，检出率为78.1%，从这些阳性样品中分离到50株副溶血性弧菌，编号设为Vp01～Vp50。经PCR扩增法检测菌株携带毒力基因tdh和trh情况，结果显示，所有副溶血性弧菌菌株均未检出tdh基因，3株菌检出trh基因，部分菌株的trh基因的电泳结果如图1所示。

图1 部分副溶血性弧菌分离株trh基因的PCR检测结果Fig.1 PCR amplification result of trh genes in some V.parahaemolyticusisolates

2.2 药敏试验 分离的50株副溶血性弧菌对18种抗生素的耐药性结果见表3。从结果可以看出，所有菌株对头孢拉定100%耐受，对氨苄西林和阿莫西林高度耐药，耐药率均为96%，所有菌株对头孢曲松、头孢吡肟、庆大霉素、诺氟沙星、萘啶酸100%敏感，部分菌株对头孢呋新钠、链霉素、四环素、土霉素、复方新诺明耐受。少量菌株出现耐受3类抗生素以上的多重耐药性，其中1株菌耐3类抗生素，耐药谱为氨苄西林－阿莫西林－头孢拉定－链霉素－复方新诺明，2株菌耐4类抗生素，耐药谱为氨苄西林－阿莫西林－头孢拉定－链霉素－四环素－土霉素－复方新诺明。分离到的3株trh基因阳性菌株同时耐受氨苄西林、阿莫西林和头孢拉定。

3 讨 论

我国海水虾养殖产业规模巨大，据统计2011年产量达到89.5万吨。海水虾等水产品由于特殊的生活环境和生理特性，很容易富集致病性微生物，最常见的为致病性弧菌，其中副溶血性弧菌为最典型、分布最广。张淑红等报告河北省海水虾中副溶血性弧菌检出率为55.4%[4]，叶菊莲等报告杭州市检出率高达94.9%[5]，本文为78.1%，可见海水虾中副溶血性弧菌的污染情况是很严重的。

表2 副溶血性弧菌分离株药敏试验结果Tab.2 Antimicrobial resistance of V.parahaemolyticusisolates

副溶血性弧菌能引发食物中毒，溶血毒素是副溶血性弧菌最主要的致病因子，分别由tdh基因、trh基因和tlh基因编码，本实验分离的菌株均不含tdh基因，只有3株含有trh基因，结果与报道的一致[6－7]。至于分离到的trh基因阳性菌株的致病性如何，有待进一步的试验验证。

抗生素的使用在水产养殖治疗病害方面起到了积极作用。但是不规范使用或滥用时有发生，由于水产养殖特殊的环境，抗生素使用极易扩散，易致耐药菌株的出现和蔓延。并可通过以下两种途径对人类产生危害：一是通过食物链直接感染人类；二是水产养殖环境及其耐药菌作为耐药基因储存库，通过扩散终致人类产生耐药性。

Devi等[8]从养殖对虾中分离到的副溶血性弧菌全部对氨苄西林和多粘菌素B耐受，对呋喃唑酮耐药率大于75%，对链霉素、卡那霉素、新霉素耐药率约50%，对庆大霉素、金霉素耐药率约30%，对氯霉素耐药率约15%，此外，对土霉素、头孢氨苄、甲氧苄胺嘧啶有一定耐受性，耐药率约7%～8%，研究者还对从虾养殖场的底泥和水样中分离的副溶血性弧菌进行耐药性分析，发现这些菌株的耐药谱和耐药率与产品中分离的菌株基本一致。Kitiyodom等[9]从养殖斑节对虾中分离到25株副溶血性弧菌，其中17株耐氨苄西林、11株耐红霉素、6株耐磺胺甲基异噁唑、4株耐四环素，3株耐链霉素和甲氧苄胺嘧啶。本实验的耐药性结果发现，分离菌株的耐药程度没有报道的严重，耐药谱也不同，可能是不同国家或地区、不同的养殖模式导致用药程度不一样，还有不同环节采样可能也会导致菌株的耐药性不一样。

目前山东沿海地区海水虾多采用池塘养殖的模式，弧菌病是海水虾常见的病害之一，养殖过程中治疗弧菌病常用的药物有氨基糖苷类、四环素类、磺胺类等药物。从结果可以看出，海水虾中分离的部分副溶血性弧菌对这几类药物存在一定耐受性，有可能是养殖过程中使用了这些药物，在这些药物胁迫作用下菌株获得了耐药基因，从而产生耐药性。考察零售环节分离菌株的耐药性对于评价在消费终端与消费者直接接触的产品存在的安全风险具有重要意义，然而在零售环节分离菌株的耐药严重程度与养殖环节相比是否会减轻，有待进一步的研究。实验还发现，分离菌株对较早使用的抗生素如第一代头孢类——头孢拉定100%耐受，对氨苄西林和阿莫西林近乎100%耐受，这些药物在海水虾养殖过程中极少使用，说明这些抗生素的耐药基因在环境中已经普遍存在。

总之，青岛市售养殖海水虾中副溶血性弧菌污染程度较严重，分离菌株具有不同程度的耐药性，还出现了耐受3类以上抗生素的多重耐药现象，分离到的含有trh毒力基因的菌株对3种抗生素耐受。

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