一起儿童病毒性脑炎暴发肠道病毒ECHO6型分离株VP1基因特征分析

陈前进，曹春远，吴水新，杨秀惠，罗招福，何 云，廖亦红

2.福建省疾病预防控制中心，福州 350001

2010年6月福建省龙岩市长汀县发生一起由埃可6型（ECHO6型）肠道病毒所致儿童病毒性脑炎暴发流行[1]。为了解引起本次暴发ECHO6型病毒分子生物学特性、致病性、病因及其基因进化情况。本研究从20份脑脊液标本分离到的13株病毒中，随机选取4株病毒进行基因特征分析。

1 材料与方法

1.1 病毒分离与中和鉴定 方法见参考文献[1]，用人横纹肌细胞（RD）进行病毒分离，阴性盲传两代。用中和试验鉴定病毒，所用诊断血清为WHO赠送的荷兰研制的肠道病毒组合血清（RIVM），所有的步骤及结果判定均按说明书进行。

1.2 VPl区核苷酸序列分析

1.2.1 病毒核酸提取 取病毒上清500μL，用QIAGEN Viral RNA Mini Kit（CAT：52906）进行病毒RNA核酸提取。所有操作步骤均按说明书进行。

1.2.2 引物的设计与合成 经过对ECHO6的序列 比 对，基 于 “Human echovirus 6strain ECHO6Henan1162008”序列设计引物。引物由中山大学达安基因股份有限公司合成。两对引物扩增的长度分别为779和660bp，分段扩增后进行序列拼接，取ECHO6VP1基因全长为876bp。包含VP1区的引物设计位置、名称、序列见表1。

表1 引物位置、名称、序列Tab.1 Primers’sites，names，and sequences

1.2.3 RT－PCR One－step PCR：SuperScript®III One－Step RT－PCR System with Platinum®Taq High Fidelity（Invitrogen）。反应体系组成如下：2XReaction Mix12.5μL（下同），RNA 模板5 μL，上游引物F（10pmol／μL）0.5μL，下游引物 R（10pmol／μl）0.5μl，RT／Platinum®Taq Mix 0.5 μL，ddH2O6μL。反应条件为：50。C 30min（下同），95。C15分钟，然后94。C30秒，55。C30秒，72。C30秒共40循环。PCR产物用1%琼脂糖进行电泳检测。

1.2.4 克隆测序及VPl区核苷酸序列分析 将PCR产物进行克隆，载体为Takara公司的PMD18－T。经过菌液PCR验证后，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。测序结果采用DNAStar 7.0软件进行拼接，与参考病毒株经ClustalX 1.8l软件标准化后，参考文献[2]，利用 Mega 4.0软件，采用邻接（NJ）法进行拼接。将VP1序列提交至GenBank。

1.3 病毒信息 本次所测得基因序列已提交Gen－Bank，获 得 登 录 号：JQ729993 （FJLY2010327）、JQ729994（FJLY2010330）、JQ729995（FJLY2010338）、JQ729996（FJLY2010333）。所有参与同源比对序列信息见表2，其中JQ729993为FJLY2010327分离株的全基因序列（本次采用其VP1区基因序列）。

2 结 果

2.1 病毒鉴定 20份脑脊液标本进行细胞培养，13份病毒分离阳性，中和试验结果均为ECHO6型[1]。对其中4株病毒分离株VP1区序列扩增，均获得预期的阳性结果（图1）。VP1序列经BLAST比对显示：所测序列与非ECHO6肠道病毒株核苷酸同源性均低于75%，与ECHO6标准株U16283同源性77%，说明此次暴发病原体为ECHO6，见图2。

图1 ECHO6VP1RT－PCR产物电泳结果1－4：ECHO6－6F和6R扩增产物；5－8：ECHO6－5F和5R扩增产物Fig.1 RT－PCR products of ECHO6VP1 1－4：PCR amplifications by primer ECHO6－6Fand 6R；5－8：PCR amplifications by primer ECHO6－5F and 5R.

表2 ECHO6型病毒参考毒株概况Tab.2 Background of ECHO6of the reference strains

2.2 同源性分析 根据测序结果分析发现，4株病毒株VP1区中除FJLY2010338株长866bp外，其他病毒株长867bp。本研究4个病毒株之间同源性高，VP1核苷酸和氨基酸序列同源性均达到99%以上。与河南省2008年病毒分离株之间的同源性分别为92.4%～94.5%和97.3%～100.0%；与山东省2008年病毒分离株之间的同源性分别为93.8%～96.2%和99.3%～99.6%；与前苏联地区、法国等国外毒株的同源性分别为84.4%～89.3%和98.9%～99.6%；而与ECHO6原型株（U16283）的同源性只有77.4%和93.6%。通过上面的数据比较发现，4个病毒株均与山东病毒株E6／SD／sewage／081226／2－2同源性高于其他参考株，与原型株的差异较大，见图2。

通过与参考序列“Human echovirus 6strain Echo6／Henan／116／2008”氨基酸序列的比对，4个病毒株与参考序列比对。由结果可知：4个病毒株的突变性很小。4个病毒株之间比对不一致的部分及四个病毒株与参考序列比对不一致的部分，大约70个突变位点。

2.3 遗传进化树分析 将GenBank中检索到的ECHO6进行比较筛选，将筛选得到的45株来自不同国家、不同地区、不同时期的ECHO6分离株与本实验分离ECHO6病毒株的VP1区全基因核苷酸序列进行比较，并构建进化树。按VP1基因序列全长核苷酸差异大于20%可将其分为2个基因型，以ECHO29－JV－10株为外部组，ECHO6可以划分为4个基因型，基因型A包括原型株和美国本土株。基因型B病毒株主要来自前苏联地区。31株ECHO6属于基因型C，病毒株分别来自韩国、前苏联地区、法国、澳大利亚和中国河南、安徽、山东省，时间为1998－2010年，可进一步划分为C1－4的4个亚型。基因型D为新划分群，包含2株病毒，均来自中国山东省。本实验4株分离病毒株在进化树上同属一个分支（图3），均属于C2亚型。

图2 VP1区核苷酸与氨基酸序列同源矩阵分析图注：1－14分别表示对应病毒株。病毒株信息包括：GenBank登录号和基本信息；黑色方块以上数值为图示病毒株VP1区核苷酸序列两两比较的同源性匹配率，黑色方块以下数值为图示病毒株VP1区氨基酸序列两两比较的同源性匹配率。Fig.2 Matrix analysis of nucleotide sequences and amino acid sequences homology of VP1coding region 1－14：Denote the corresponding virus strain.Virus information includes：GenBank logon number and basic information；the numbers above black box are the homology matching rate of pairwise comparisons on VP1region nucleotide sequences of the virus strains；the numbers below black box are the homology matching rate of pairwise comparisons on VP1region amino acid sequences of the virus strains.

3 讨 论

病毒性脑膜脑炎的病因有多种，但主要由肠道病毒引起。由肠道病毒引起的无菌性脑膜炎在国内外屡见报道。2004年浙江省临海市儿童突发不明原因脑炎[3]、舟山市普陀区病毒性脑炎暴发疫情[4]、2011年厦门市某医院10例无菌性脑炎暴发病例[5]均由ECHO30型引起。ECHO6是人类肠道病毒属的血清型之一，可引起病毒性脑炎、手足口病等多种疾病，侵袭对象以1岁以下婴幼儿为主，国内外均有由ECHO6引起的公共卫生事件报道。2005年安微省六安市金寨县曾发生一起由ECHO6感染引起的病毒性脑炎暴发疫情，共发病105例[6]。龙岩市自2004年以来对病毒性脑膜脑炎监测医院送样的脑脊液标本进行了病毒分离，分离到ECHO19、ECHO25、ECHO30和ECHO6等肠道病毒，说明2004年以来引起龙岩市病毒性脑炎的肠道病毒中ECHO19、ECHO25、ECHO30和ECHO6为我市常见的血清型，但流行的型别交替出现[7]。其中在2009年的后期监测到ECHO6病毒，结果2010年在龙岩市长汀县发生了由ECHO6病毒引起的暴发流行[1]。同源性分析结果显示本次暴发ECHO6分离株之间同源性＞99%。由VP1核苷酸序列同源矩阵分析发现本次ECHO6分离株均与山东病毒株E6／SD／sewage／081226／2－2同源性最高。

图3 ECHO6分离株VP1区基因序列系统进化树注：星号标注为本研究克隆病毒株VP1区基因序列Fig.3 Phylogenetic tree of ECHO6based on complete VP1 gene★represents the gene sequence in VP1region in the cloning strain in this study

GenBank现已公布的ECHO6划分为4个基因型，并呈现出一定的时间和地域特征。A群近年未见出现。有消亡趋势。C群包含了来自全球各地的大多数ECHO6分离株，可以肯定是主要的流行基因型。中国存在B、C和D型的传播流行，C型较多见，B、D型目前仅山东省有报道，与全球流行趋势基本一致。中国地区报道的首例ECHO6型引起的脑炎来自于安徽省2005年暴发的脑炎患者中 ，该研究同时发现本次分离的ECHO6病毒株属于C4亚型。另外，报道 显示韩国2008年暴发的脑膜炎由ECHO6和ECHO30引起，其中ECHO6也属于C4亚型。本研究在2010年福建龙岩地区暴发的病毒性脑炎中发现本次疾病流行也是由ECHO6引起，通过病毒株亚型分析发现，本研究中分离的ECHO6病毒株属于C2亚型。与山东地区，河南地区2008－2009年报道的ECHO6病毒株同亚型。[9]

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