人乳头瘤病毒16型L1基因乳酸杆菌表达载体的构建*

罗 波，段素群，郑小莉，毛樱逾

1)泸州医学院生物化学教研室 泸州 646000 2)泸州医学院教务处 泸州 646000 3)泸州医学院病原生物学教研室 泸州 646000

现已公认，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌的主要发病因素，HPV感染与95%以上宫颈癌的发生有关[1]，尤其其中的16型(HPV16)是宫颈癌的首要启动因素，检出率约50%[2]。防治HPV感染对预防宫颈癌，减少宫颈癌的危害有重要作用。但是，HPV感染的治疗目前还没有特别有效的手段，治疗常常不彻底，易反复发作，治疗费用昂贵。因此，用HPV疫苗来预防HPV感染及由其引起的宫颈癌有重要应用价值。该研究拟从培养的宫颈癌细胞系中通过PCR方法获得HPV16 L1衣壳蛋白基因，连接到乳酸杆菌分泌表达载体pVE5523上，转化大肠杆菌Top10中保存，为将来制备可以分泌表达HPV16 L1抗原蛋白的重组乳酸杆菌，开发临床实用的生殖道HPV生物疫苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要材料电泳仪购自Bio-Rad公司，CasKi宫颈癌细胞株购于北京肿瘤防治研究所，DMEM培养基购于Sigma公司，胎牛血清购于华南理工大学，cDNA合成试剂盒购自Toyobo公司，细胞基因组DNA提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，2×Taq PCR MasterMix、TIANprep Mini 质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，限制性内切酶EcoRⅤ和SalⅠ、T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品，pVE5523质粒、Top10菌种为泸州医学院病原生物学教研室保存。其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。

1.2CasKi宫颈癌细胞株DNA的提取培养、收集CasKi细胞，按细胞基因组DNA提取试剂盒说明书的操作步骤提取DNA样品。

1.3引物的设计与合成根据 GenBank中东亚型HPV16全基因序列(基因登录号AF534061)设计扩增HPV16 L1基因的上、下游引物。上游引物5’-GCGGTCGACATGCAGGTGACTTTTATTTACA-3’，下游引物5’-GCGGATATCTAAAAATTTGCGTCCTAA AG-3’。上、下游引物5’端分别设有SalⅠ和EcoRⅤ酶切位点，目的片段长度为1 485 bp，引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成。

1.4目的基因的PCR扩增以提取的CasKi宫颈癌细胞株DNA为模板克隆HPV16 L1基因。25 μL PCR扩增体系：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min，进行30个循环(变性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 35 s，延伸72 ℃ 1.5 min)，最后72 ℃ 10 min后终止反应。PCR产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳。

1.5HPV16L1乳酸杆菌表达载体的构建HPV16 L1的PCR产物和pVE5523质粒分别用EcoRⅤ和SalⅠ双酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收HPV16 L1和pVE5523，用T4连接酶16 ℃过夜连接。将连接产物转化感受态细胞Top10，用含100 mg/L 氨苄青霉素及100 mg/L 红霉素的平板来筛选阳性克隆。阳性克隆经PCR鉴定，获得初步正确的克隆。将该克隆送TaKaRa公司测序。

2 结果

2.1HPV16L1基因的PCR扩增以提取的CasKi宫颈癌细胞株DNA为模板，PCR扩增产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，在2 000与1 000 bp中间处有一明显条带，大小与预期值相符(1 485 bp)，见图1。

图1 HPV16 L1基因PCR扩增结果

2.2HPV16L1-pVE5523重组表达质粒的鉴定挑取转化后的阳性克隆，经PCR鉴定，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见在2 000与1 000 bp中间处有一明显条带，大小与预期值相符(1 485 bp)，见图2。

图2 阳性克隆的PCR鉴定结果

M：Marker；1，2，4，5，7，10，12：假阳性克隆的扩增产物；3，6，8，9，11，13：阳性克隆的扩增产物。

2.3重组质粒的序列测定及分析将阳性克隆菌6、11号提取质粒后进行序列测定，结果显示重组质粒中插入的目的片段HPV16 L1基因与GenBank公布的序列相同，而且HPV16 L1基因插入的方向正确，未改变外源基因的阅读框架。

3 讨论

宫颈癌是世界范围内常见的妇科恶性肿瘤之一，占女性癌症发病率第2位，病死率第3位。据统计，全球每年约有50万人被诊断为宫颈癌，约20多万人因此而丧生[3]。HPV是一类感染表皮和黏膜鳞状上皮的双链环状DNA病毒，按照HPV感染与发生宫颈癌的潜在危险性，将HPV分为低危型(HPV1、HPV6、HPV11等)和高危型(HPV16、HPV18、HPV31、HPV45等)两类。高危型HPV与宫颈癌的发生有着密切的因果关系[4-6]。研究高效、价廉的HPV疫苗来预防宫颈癌，降低宫颈癌防治的成本，对降低宫颈癌的危害具有重要意义。

重组载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向。它是将病原体抗原DNA片段转入减毒病原菌或共生菌中制成疫苗，接种人体后，可在人体增殖，持续表达所编码的抗原，诱发机体免疫应答，具有免疫效力高、成本低及灭活疫苗的安全性好等优点。乳酸杆菌是女性阴道内的优势菌，对维护女性阴道的自净作用及防御外来病原体的感染、增强机体抵抗力和免疫力具有明显的作用，且无病原性的特点。因此，乳酸杆菌非常适宜作为安全的人体疫苗和其他病原体的抗原载体。但是一直以来对乳酸杆菌的遗传和分子生物学研究进展较为缓慢，对乳酸杆菌的转化系统研究不够深入，与其他医药微生物基因工程研究相比，乳酸杆菌基因工程研究进展缓慢。pVE5523载体是近年来Dieye等[7]构建的能在乳酸杆菌中分泌表达外源性基因的一种表达载体，具有较广泛的应用范围。

该研究选择HPV16的L1衣壳蛋白基因作为目的基因，已经成功连接到pVE5523质粒中，构建了HPV16 L1-pVE5523载体。通过PCR、测序等方法验证了其正确性，为下一步研制HPV16 L1的乳酸杆菌重组载体疫苗提供了有力支持。

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