食管鳞状细胞癌组织中Netrin-1的表达*

刘宗文，王文娟，田薇薇，梁 冰，杨家梅，刘 萍，张钰浩，张 艳

1)郑州大学第二附属医院肿瘤科 郑州 450014 2)新乡医学院第三附属医院神经内科 新乡 453000 3)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001

Netrin-1是一种层黏连相关的分泌性蛋白，可以调控细胞的存活和其受体家族DCC(deleted in colorectal cancer)以及UNC-5H(uncoordinated-5-homolog)的活性，从而在诱导细胞凋亡中发挥关键性的作用[1]。目前，许多研究[2-3]表明，Netrin-1与结肠癌、肺癌等多种肿瘤的发生发展关系密切。然而，迄今为止，尚未见关于Netrin-1与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的研究报道。为了初步阐明Netrin-1在ESCC组织中的表达情况，该研究利用原位杂交技术和免疫组化方法检测ESCC组织和正常食管黏膜组织中Netrin-1 mRNA和蛋白的表达，旨在以Netrin-1为靶点探讨ESCC的发生机制，并为食管癌的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料40例ESCC手术切除标本取自郑州大学第二附属医院病理科2008年9月至2010年6月的手术存档蜡块，同时另取40例正常食管黏膜组织作为对照，所有病例在手术前均未接受任何形式的治疗，包括放疗、化疗和免疫治疗。ESCC组中男27例，女13例；年龄43～81(58.2±11.7)岁。对照组中男29例，女11例；年龄38～77(55.8±8.5)岁。40例ESCC组织中组织学分化程度Ⅰ级18例，Ⅱ级10例，Ⅲ级12例；浸润深度达浅层者(浅肌层及其以上)22例，深层者(深肌层及其以下)18例；无淋巴结转移者26例，有淋巴结转移者14例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期17例。上述所有标本经40 g/L多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋和连续切片(厚度4～6 μm)，分别用于免疫组化和原位杂交染色。兔多克隆抗体Netrin-1购自美国Abcam公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。原位杂交5’端生物素标记、全硫代修饰探针由北京奥科生物技术有限公司合成，探针序列5’-CTCCACGCAGTGCCGCAAGA-3’。

1.2免疫组化及原位杂交方法免疫组化采用PV9000法，Netrin-1抗体稀释倍数为1150，DAB显色，苏木素复染。以PBS液代替一抗作为阴性对照。原位杂交切片经新鲜配制的二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水后，用新鲜配制的体积分数0.5% H2O2室温处理30 min，以灭活内源性过氧化物酶；体积分数3%柠檬酸新鲜配制蛋白酶(0.01 g/L)，37 ℃ 10 min，消化标本DNA结合蛋白；每张玻片滴加20 μL不含Netrin-1探针的预杂交液(42 ℃)，预杂交4 h；加含探针(1 mg/L)的杂交液，42 ℃湿盒内杂交 12～16 h；0.1×标准柠檬酸盐(SSC)42 ℃洗后，加SA-Bio-AP,37 ℃ 10 min；漂洗后加BCIP/NBT显色剂，避光显色0.5～2.0 h。

1.3结果判断Netrin-1蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。Netrin-1 mRNA阳性信号呈紫蓝色颗粒，位于细胞质内。高倍镜下选取5个视野(每个视野观察细胞数不少于200个)，按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定[4-5]。①按切片中细胞着色深浅评分：0分，细胞无显色；1分，浅黄色(浅蓝色)；2分，棕黄色(蓝色)；3分，棕褐色(紫蓝色)。②按阳性细胞百分比评分，<30%为1分，30%～70%为2分，>70%为3分。取2项评分的乘积作为总积分，0～1分为阴性(-)，≥2分为阳性(+)。

1.4统计学处理应用SPSS 11.0进行统计学处理。ESCC和正常食管黏膜组织中Netrin-1阳性表达率的比较、不同病理学特征ESCC组织中Netrin-1阳性表达率的比较均采用χ2检验，ESCC组织中Netrin-1蛋白及mRNA表达的关联性分析采用Pearson列联系数。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1ESCC和正常食管黏膜组织中Netrin-1的表达Netrin-1蛋白及mRNA阳性表达均位于细胞质中，蛋白阳性信号呈浅黄色至深黄色，mRNA阳性信号呈不同程度紫蓝色颗粒(图1)。结果见表1。

图1 正常食管黏膜(A、C)和ESCC组织(B、D)中Netrin-1蛋白和mRNA的表达(×200)

组织类型nNetrin-1蛋白Netrin-1 mRNAESCC4019(47.5)21(52.5)正常食管黏膜402(5.0)2(5.0)χ218.66022.029P<0.001<0.001

2.2Netrin-1表达与ESCC病理学特征的关系结果见表2。

表2 Netrin-1蛋白及mRNA表达 与ESCC病理学特征的关系 阳性例数(%)

2.3ESCC组织中Netrin-1蛋白及mRNA表达的关系结果见表3。

表3 ESCC组织中Netrin-1蛋白及mRNA表达的关系 例

rP=0.517,P<0.001。

3 讨论

Netrin是首次在秀丽隐杆线虫中筛选调控神经发育的蛋白时被鉴定[6]。在哺乳动物中，5个Netrin基因已经被鉴定，包括Netrin-1、3、4、G1和G2。其中Netrin-1、3、4为分泌型，而Netrin-G1和G2能够通过羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇尾锚锭于质膜上[7-8]。Netrin-1的C结构域，也被称为Netrin样单元，为具有多种不同生物学功能的一些相似的结构域，具有高度的同源性。分泌型Netrin(Netrin-1、3、4)的C结构域不需要结合于受体DCC或UNC-5同源物上[9-11]。UNC-6的C结构域在线虫中的缺失产生轴丝导向缺失，但与完全的UNC-6功能缺失相比，其作用相对较小[12]。Netrin-1与肿瘤的发生发展密切相关。Delloye-Bourgeois等[13]研究发现，92例非小细胞肺癌组织中43例表达Netrin-1，其阳性表达率为47%，表明Netrin-1可能在肺癌的发生发展中发挥重要作用。此外，与人类非转移乳癌不同的是，Netrin-1在转移的乳癌细胞中过表达，其在淋巴结转移阳性患者中比淋巴结转移阴性患者中的表达量显著提高，大约31.5%的淋巴结转移阳性的乳癌患者中Netrin-1的表达水平至少提高5倍[14]。在卵巢癌的研究[15]中发现17例卵巢癌组织中有13例呈现Netrin-1的阳性表达，其阳性表达率为76.5%，但是在正常组织中尚未发现Netrin-1的表达。这些研究表明Netrin-1与肿瘤的发生发展关系密切，因而有望成为肿瘤治疗的新的分子靶点。

该研究结果显示，40例ESCC组织中21例(52.5%)呈现Netrin-1 mRNA的阳性表达，高于正常食管黏膜组织的阳性表达率5.0%。此外，蛋白表达分析结果显示，40例ESCC组织中19例(47.5%)呈现Netrin-1蛋白的阳性表达，也高于正常食管黏膜组织的阳性表达率5.0%。进一步分析发现，Netrin-1 mRNA和蛋白的表达均与患者的组织学分级、浸润深度、TNM分期以及淋巴结转移情况有关。另外ESCC组织中Netrin-1蛋白与mRNA的表达有关联。这提示Netrin-1 mRNA和蛋白可能在ESCC的发生发展中发挥重要作用，但其具体的分子机制还有待进一步的探讨。

该研究结果提示，Netrin-1在ESCC组织中呈阳性表达，其阳性表达可能在ESCC的发生发展中发挥重要作用。进一步研究ESCC组织中Netrin-1的分子调控机制有望为以Netrin-1为靶点的ESCC的诊断和治疗提供理论依据。

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