淫羊藿苷与金雀异黄酮对大鼠峰值骨量的影响

成 魁，葛宝丰，甄 平，陈克明，马小妮，周 建，宋 鹏，马慧萍

中国人民解放军兰州军区兰州总医院 1骨科研究所 2药剂科，兰州730050

骨质疏松症是一种普遍随年龄增长而形成的骨和矿物质紊乱的疾病［1］，骨质疏松症由峰值骨量和年龄增长相关的骨丢失两方面决定［2］。峰值骨量是骨成熟末期达到的最大骨量，是骨最坚硬和骨矿含量最高的时期［3］，更高峰值骨量会减缓发病的概率［4］。因此，提高峰值骨量是一条预防骨质疏松的理想途径。Bhargavan等［5］报道，通过口服美迪紫檀素提高峰值骨量可达到预防骨质疏松症的目的。淫羊藿具有强筋健骨之功效，常用于治疗骨质疏松或促进骨折愈合［6］。淫羊藿苷 (icariin，ICA)是淫羊藿中含量最为丰富的黄酮苷类化合物，金雀异黄酮是豆科植物中的一种异黄酮，是近年较受关注抗骨质疏松新药［7］。ICA比金雀异黄酮 (genistein，GEN)在8位碳上多1个异戊烯基，有研究表明，ICA比GEN能更强地促进成骨细胞成骨性分化和矿化成熟［8］。本研究通过口服 ICA与GEN，探讨其对大鼠峰值骨密度和骨质量的影响，以期对ICA抗骨质疏松活性作出初步判断，并探索其中更强活性的药物。

材料和方法

材料 1月龄SD雌性大鼠36只，SPF级，体重(125±3)g，由甘肃中医学院实验动物中心提供 ［合格证号:SCXK(甘)2004-0006-152］;淫羊藿苷、金雀异黄酮购自陕西宝鸡辰光生物科技有限公司，纯度≥98%;抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒和骨钙素试剂盒为英国IDS公司产品;Technovit@9100试剂盒为Heraeus Kulzer GmbH＆Co.KG公司产品;双能X射线骨密度仪 (GE公司，美国)、显微 CT(Micro-CT，μCT)(MILabs公司，荷兰)和AG-IS万能材料实验机 (岛津公司，日本)均为本实验室仪器。

分组和给药 实验大鼠随机抽样法分为3组，每组12只，一组每日灌服淫羊藿苷，称为服药组，一组每日灌服金雀异黄酮，称为阳性对照组，另一组只给予等体积蒸馏水，称作对照组。淫羊藿苷用蒸馏水配成2.5 g/L的混悬液。按每只大鼠25 mg/kg体重给药。金雀异黄酮用蒸馏水配成1 g/L的混悬液。按每只大鼠10 mg/kg体重给药。大鼠饲养于SPF级实验室，自由摄水和进食，记录每日进食量和进水量，每周称1次体重。

脏器常规病理学 动物处死后讯即剥离出心脏、肝脏、胃、肾、肾上腺和子宫，称重，计算器官指数，并将所有器官固定于10%福尔马林中，石蜡包埋，常规切片，HE染色，由高年资深病理医师进行病理学观察与评价。

骨密度的测定 每月在麻醉状态下测1次全身骨密度，第3个月测完后即处死所有动物，剥离出四肢长骨，左侧股骨用于检测骨密度。麻醉采用10%水合氯醛，剂量为3 ml/kg，腹腔注射。

血清生化指标的测定 采用心脏取血法抽取血样，4000 r/min离心10 min(转子半径为10 cm)，取上层血清，－80℃保存;按试剂盒说明书制作骨钙素(osteocalcin，OC)和抗酒石酸性磷酸酶5b(anti-tartaric acid phosphatase 5b，TRACP 5b)标准曲线，OC于450 nm、TRACP 5b于405 nm处测定吸光度值，通过标准曲线计算出含量。

μCT影像分析 将右侧股骨用70%酒精固定。感兴趣区域选择在距生长板1 mm位置。分析参数包括相对骨体积率、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度和模型系数，并采集成像图片。

骨形态计量分析 将右侧胫骨固定于70%酒精中。严格按照technovit@9100试剂盒操作说明书依次进行脱水、脱塑、浸渍、渗透和包埋，聚合2 d后切片，磨片，用VG法染色，观察骨骺线下1～4 mm距离区域。

生物力学分析 将左侧股骨用浸透0.9%生理盐水的纱布包裹后保存于－20℃。在实验24 h前取出，于室温下自然解冻。3点弯曲实验的跨距为17 mm，速度为10 mm/min。记录载荷变形曲线，得到包括最大载荷、屈服强度和弹性模量等指标。

统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件完成，所有检测数据均用均数±标准差表示，不同组间差异采用单因素方差分析 (One-way ANOVA)，组间两两比较用LSD检验法 (方差齐)。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

进食量、进水量和体重 3组大鼠的每日进食量和进水量差异无统计学意义 (P＞0.05)，体重虽然有随时间增长而增加的趋势，但差异无统计学意义 (P＞0.05)(图1)。

脏器常规病理学 3组心脏、肝脏、胃、肾、肾上腺和子宫的器官指数差异无统计学意义 (P＞0.05);且常规病理学观察无异常改变。

骨密度 3组大鼠的全身骨密度在实验开始时、服药后1个月和服药后2个月差异均无统计学意义，但服药后3个月差异具有统计学意义 (P＜0.05)。股骨骨密度与全身骨密度变化趋势一致 (表1)。

血清OC和TRACP 5b含量 ICA组大鼠血清OC、PINP水平显著高于对照组 (P＜0.05，P＜0.01);而血清TRACP 5b、CTX-I水平显著低于对照组 (P＜0.05，P＜0.01)(表2)。

μCT影像 ICA组相对骨体积率、骨小梁数和骨小梁厚度明显高于对照组组 (P＜0.05)，但骨小梁分离度和模型系数明显低于对照组组 (P＜0.05)，GEN模型系数较对照组显著降低，ICA组与GEN组差异无统计学意义 (P＞0.05)(表3、图2)。

骨形态计量分析 胫骨骨形态计量分析显示，ICA组骨小梁数和骨小梁厚度显著高于对照组与GEN组 (P＜0.05)，但骨小梁分离度显著低于对照组与GEN组 (P＜0.05)(图3)。

图1 大鼠体重的变化Fig 1 The body weight of rats during experiment

表1 不同时间大鼠全身骨密度和股骨骨密度检测结果 (n=12，±s，g/cm3)Table 1 Total and femur bone mineral density of rats at different time points(n=12，x-± s，g/cm3)

表1 不同时间大鼠全身骨密度和股骨骨密度检测结果 (n=12，±s，g/cm3)Table 1 Total and femur bone mineral density of rats at different time points(n=12，x-± s，g/cm3)

TBMD-M0:开始服药前全身骨密度;TBMD-M1:服药1个月后全身骨密度;TBMD-M2:服药2个月后全身骨密度;TBMD-M3:服药3个月后全身骨密度;FBMD-M3:服药3个月后股骨骨密度;与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01;与GEN组比较，cP＜0.05TBMD-M0:basal total bone mineral density;TBMD-M1:total bone mineral density after experiment 1 month;TBMD-M2:total bone mineral density after experiment 2 month;TBMD-M3:total bone mineral density after experiment 3 month;FBMD-M3:femur bone mineral density after experiment 3 month;aP ＜0.05，bP＜0.01 compared with control group;cP＜0.05 compared with GEN group

组别Group TBMD-M0 TBMD-M1 TBMD-M2 TBMD-M3 FBMD-M3对照组Control group 0.112±0.006 0.140±0.007 0.151 14 0.151±0.015 0.146±0.010±0.008 0.148±0.01 0.144±0.006 ICA组ICA group 0.111±0.006 0.144±0.007 0.153±0.009 0.160±0.01ac 0.154±0.009bc GEN组GEN group 0.112±0.006 0.143±0.012 0.147±0.0

表2 大鼠血清OC和TRACP 5b的含量 (n=12，±s)Table 2 Serum OC and TRACP 5b of rats(n=12，±s)

表2 大鼠血清OC和TRACP 5b的含量 (n=12，±s)Table 2 Serum OC and TRACP 5b of rats(n=12，±s)

OC:骨钙素;TRACP 5b:抗酒石酸性磷酸酶5b;PINP:Ⅰ型前胶原氨基端前肽;CTX-Ⅰ:Ⅰ型胶原C末端肽;与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01 OC:osteocalcin;TRACP 5b:anti-tartaric acid phosphatase 5b;PINP:N-terminal propeptide of typeⅠ procollagen;CTX-Ⅰ:C-terminal propeptide of typeⅠcollagen;aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group

组别Group OC(ng/ml)TRACP 5b(U/L)PINP(pg/ml)CTX-I(pg/ml)对照组 Control group 0.07279±0.00155 0.73±0.18 0.0±0.00005 0.02120±0.00005 3716±0.00001 0.02324±0.00003 ICA组ICA group 0.07491±0.00134a 0.59±0.08a 0.03922±0.00004b 0.02116±0.00007b GEN组GEN group 0.07447±0.00188 0.71±0.18 0.03921

表3 大鼠股骨显微CT分析结果 (n=5，±s)Table 3 Femurs of rats as analyzed by micro-CT(n=5，±s)

表3 大鼠股骨显微CT分析结果 (n=5，±s)Table 3 Femurs of rats as analyzed by micro-CT(n=5，±s)

与对照组组比较，aP＜0.05，bP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group

组别Group模型系数Structural model index对照组 Control group 31.898± 1.486 2.419±0.091 0.13相对骨体积率Bone volume/tissue volume(%)骨小梁数量Trabecular number(/mm)骨小梁厚度Trabecular thickness(mm)骨小梁分离度Trabecular spacing(mm)2±0.001 0.433±0.084 0.920±0.190 ICA组ICA group 45.263± 6.060a 3.012±0.173b 0.152±0.010a 0.249±0.045a 0.347±0.233b GEN组GEN group 43.948±11.337 2.807±0.283 0.151±0.025 0.388±0.153 0.365±0.219a

图2 大鼠股骨显微CT影像Fig 2 Three-dimensional reconstruction of the femur micro-CT

图3 大鼠股骨骨形态图片 (×40)Fig 3 Bone histomorphometry in rat(×40)

骨生物力学 股骨三点弯曲实验显示，ICA组的最大载荷和弹性模量显著高于对照组 (P＜0.01)，GEN组的最大载荷显著高于对照组 (P＜0.05)，ICA组与GEN组的屈服强度均显著高于对照组(P＜0.05)(表4)。

表4 大鼠骨生物力学结果 (n=12，±s)Table 4 Biomechanics of the femurs of rats(n=12，±s)

表4 大鼠骨生物力学结果 (n=12，±s)Table 4 Biomechanics of the femurs of rats(n=12，±s)

与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group

组别Group最大载荷Maximum load(N)弹性模量Youg’s modulus(mPa)屈服强度Yield load(N)对照组Control group 125.0±17.7 1526.2±247.3 114.2±14.5 ICA组ICA group 156.2±14.3b 2288.5±305.8b 138.2±30.4a GEN组GEN group 144.1±19.3a 2001.0±648.9 136.6±23.9a

讨 论

峰值骨量与骨质疏松密切相关，高峰值骨量人群患骨质疏松症的概率相对较低峰值骨量者低，所以获得高水平的峰值骨量是潜在预防骨质疏松的方法。近年众多学者采用刚断乳后1个月龄雌性大鼠作为实验动物，通过研究峰值骨量探寻解决骨质疏松的途径。

GEN是一种较为公认的治疗骨质疏松症的药物，本研究参考选择该药物浓度10 mg/kg体重［9］，并换算成同样摩尔浓度的ICA，即25 mg/kg剂量，在给药的分子量一致的前提下，对比研究两种药物的药效。在口服ICA与GEN 3个月后，大鼠饮食无变化，未产生毒副作用。与对照组和GEN组相比，ICA显著提高了全身骨密度与股骨骨密度，而服药3个月的时间与大鼠骨重建周期需3个月是一致的［10］，表明ICA影响骨密度的能力强于GEN。骨质量主要与骨组织微结构有关，而μCT可以准确并直观反映骨微结构和形态［11］。本研究μCT检测显示，ICA能提高骨小梁的网状结构交联度，从而使大鼠骨质紧密，明显改善骨微结构，而GEN出现提高的趋势，但差异无统计学意义。骨生物力学参数可较直接地反映骨的抗骨折能力，代表骨硬度。口服ICA与GEN后均显著提高了大鼠的生物力学性能，即抗骨折的能力，GEN组生物力学能力的提高可能是骨组织微结构的改善，但ICA提高骨生物力学能力的值均高于GEN。通过提高体内骨形成水平和抑制骨吸收水平，可以提高骨量。血清骨钙素、Ⅰ型前胶原氨基端前肽是成骨细胞分泌的酶，是骨形成的特异性指标，抗酒石酸性磷酸酶5b、Ⅰ型胶原C末端肽是破骨细胞分泌的酶，是骨吸收的特异性指标。在血清骨钙素、抗酒石酸性磷酸酶5b、Ⅰ型前胶原氨基端前肽和Ⅰ型胶原C末端肽的检测中显示，ICA组大鼠体内骨形成的水平提高，同时骨吸收的水平下降，而GEN未提高骨形成抑制骨吸收，这可能是ICA组大鼠骨密度高于GEN的主要原因。

口服淫羊藿苷与金雀异黄酮3个月后对比研究显示，淫羊藿苷提高骨密度的能力强于金雀异黄酮，而且对骨硬度的提高能力具有同样的表现。其原因是淫羊藿苷提高骨形成抑制骨吸收的能力强于金雀异黄酮，而且金雀异黄酮对骨组织微结构的改建弱于淫羊藿苷，导致骨质量与骨强度的差异;淫羊藿苷结构带有的8-异戊烯基可能也是造成淫羊藿苷具有更强活性的原因。但8-异戊烯基基团与骨质疏松的关系尚待进一步深究。

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