稳定表达小鼠甘丙肽的N-2a细胞株的建立及内源性过表达甘丙肽对N-2a细胞增殖和凋亡的影响

荣 曼，张锐虎，刘田福

山西医科大学实验动物中心，太原030001

甘丙肽 (galanin，GAL)是由29～30个氨基酸构成的神经肽，广泛分布于中枢和周围神经系统，它参加摄食、学习记忆、痛觉和神经性损伤、修复与退行性变等一系列生物活动，研究显示甘丙肽通过3种与G蛋白相偶联的受体 (GalR1、GalR2、GalR3)调节一系列生物和行为学效应，在神经元发生、发育、生长和衰老过程中甘丙肽的作用更是引起了广泛的关注［1］。小鼠神经母瘤细胞 Neuro-2a(N-2a)来源于Albino A系小鼠的自发神经母细胞瘤，形态似神经样干细胞，在一定的环境下具有短时间内分化为神经元的潜能［2］。小鼠神经母细胞瘤株N-2a因其形态变化迅速常用作研究神经分化、损伤和药物作用的体外模型，也是常用于研究神经毒性的细胞株［3］。本研究选用N-2a细胞作为神经细胞研究模型，通过脂质体法转染细胞实现由血小板源性的生长因子B启动子(platelet derived growth factor-B，PDGF-B)驱动目的基因GAL在N-2a细胞的过表达，并探讨其对细胞增殖及凋亡的影响。

材料和方法

材料 细胞:N-2a购自中国科学院上海生命科学研究院;菌株和质粒:pcDNA 3.1由本实验室保存，大肠杆菌DH5a、pMD-19T载体均购自宝生物工程(大连)有限公司。试剂和培养基:DNA平末端加A试剂盒，反转录PCR试剂盒，RNA提取试剂盒均购自宝生物工程 (大连)有限公司;澳洲血源特级胎牛血清购自北京元亨金马生物技术开发有限公司;LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。主要引物:RTPCR、常规PCR引物均参照GenBank中GAL基因和cDNA的标准序列，使用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0软件进行设计分析。PCR正向引物F:5’-GAAGATCTGGATCCACAGTCTCCTGAGTA-3’，反向引物 R:5’-CCGCTCGAGCAGTCCCAGATACTTGCTAG-3’;RT-PCR 正 向引物 F:5’-GCAGTAAGCGACCATCCAGC-3’，反向引物 R:5’-AGGACACACGTGCACAGTGG-3’;内参正向引物 F:5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3’，反向引物 R:5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’，由Invitrogen公司合成。

细胞培养 从液氮中取出冻存细胞立即放入40℃水浴，震荡使其快速溶解1 min，然后移入含有9 ml完全培养基的离心管中，室温下1200 r/min离心收集沉淀，吹吸混匀后移入培养瓶中继续培养。N-2a细胞用全血清DMEM培养液 (10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素)在75 cm2培养瓶中附壁生长培养，细胞达到80%汇合时以1∶3进行传代。选第3～6代细胞以2×107/ml进行冻存，冻存前1天更换新鲜培养基，冻存液含20%胎牛血清、5%DMSO，冻存过程:4℃ 20 min，－20℃ 30 min，－80℃过夜后投入液氮长期保存。

Acta Acad Med Sin，2013，35(5):524 －529

建立稳定转染小鼠PDGF-GAL的N-2a细胞株细胞瘤细胞生长汇合率为70%时收获细胞，转入两个6孔板，培养至80%以上汇合时分成两组，阳性转染组 (脂转PcDNA 3.1-GAL质粒转入N-2a细胞):6孔板中随机抽取4孔，每孔加完全培养基2 ml、含脂质体2000 10 μl的DMEM 培养基250 μl、含GAL重组质粒4.0 μg的DMEM培养基250 μl;阴性对照组 (脂转PcDNA 3.1质粒转入N-2a细胞):6孔板中任选4孔，每孔加完全培养基 2 ml、含脂质体 2000 10 μl的DMEM 培养基 250 μl、含 PcDNA 3.1 质粒 4.0 μg的DMEM培养基250 μl;空白对照组:6孔板中其余孔分别标记为*，每孔加DMEM培养基2.25 ml、含lipofectamine 2000 脂质体10 μl的 DMEM 培养基 250 μl。6孔板置于37℃、5%CO2、90%湿度条件下脂转4 h后更换为完全培养基。

瞬时转染后48 h分别于上述各组中每孔细胞加入500 ng/μl G418进行筛选，当显微镜下空白对照组细胞全部死亡，而转染组细胞持续加压至细胞不再死亡，且以团簇的形式生长时即可认为是阳性细胞，单细胞显微操作法获得转染后抗G418阳性细胞于96孔培养板进行培养，具体操作方法:用胰蛋白酶消化欲分离的细胞，调整细胞浓度为1×103/ml，取2 ml细胞悬液加入无菌培养皿，然后用自制的毛细吸管在倒置显微镜下吸出单个细胞加入含适量新鲜完全培养基的96孔培养板中，每孔只加1个细胞，最后放入37℃含5%CO2的孵箱培养。96孔培养板中细胞长至孔底1/3～1/2面积时，再次加入200 ng/μl G418进行加压筛选5～7 d，挑选生长良好的孔板内细胞转种于24孔板扩大培养。

阳性细胞克隆中外源基因的PCR法检测 为确认所选细胞克隆中是否有转入的基因，采用PCR扩增技术，由于所用引物依照扩增外源基因片段PDGFGAL全长时设计，经多次实验证明只有转入的外源PDGF-GAL才能扩出片断。以细胞克隆基因组DNA为模板，扩增转入N-2a细胞内的外源cDNA基因片段，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，为使PCR检测特异，同时设立阴性对照和阳性对照组。

细胞克隆中GAL转录水平的检测 选取PCR鉴定阳性的细胞克隆采用Trizon法提取不同组细胞克隆总RNA，用紫外可见分光光度计测定RNA的浓度为0.52 g/L，纯度为2.0，然后以内参GAPDH为标准进行 RT-PCR，25 μl的 PCR 反应体系包括 cDNA 2 μl，10 × PCR 缓冲液 5 μl，10 mmol/L 各类 dNTP 3 μl，2.5 U Taq DNA合成酶，GAL及GAPDH正、反向引物各2 μl，无RNA酶的去离子水加至反应物总量50 μl。轻柔吹吸混匀并短暂离心收集附壁液体后，将样本置入PCR热循环仪，开始PCR反应。反应条件为:预变性:94℃，5 min;变性:94℃，30 s;退火:64℃，1 min;延伸:72℃，30 s，共循环35次。最后于72℃延伸10 min。所有标本重复测定3次。在扩增终点取5 μl的产物，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳并拍照。凝胶图像分析系统进行条带光密度扫描，以GAPDH校正做GAL相对表达量分析，数值以GAL/GAPDH表示。

Western blot法检测细胞克隆中GAL表达水平收集2×106个转染后细胞，按细胞总蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白，取30 μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE电泳并电转移至NC膜上，5%脱脂奶粉室温振荡封闭1 h，GAL抗体 (1∶200稀释)4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗 (1∶10 000稀释)室温孵育1 h，增强化学发光法检测目的蛋白。选用GAPDH为内参(一抗以1∶2000稀释，二抗以1∶10 000稀释)，蛋白含量用目的条带光密度/β-actin校正光密度表示，比较转染后N-2a细胞与对照小鼠细胞GAL蛋白表达差异。

N-2a和GAL-N-2a细胞组的增殖分析 细胞经EDTA-胰蛋白酶消化分离、离心、计数，以每孔150 μl完全培养基含1×103/孔的细胞密度接种于96孔板，37℃，5%C02培养箱中培养48 h，使细胞贴壁和细胞突起充分伸展。然后分别在细胞贴壁后0、24、48、72、96、120 h定时每孔加入20 μl MTT溶液 (5 mg/m1)，在培养箱中孵育4 h，弃培养上清，每孔加入150 μl DMS0，振荡混匀后培养箱内孵育10 min，用酶联检测仪测定波长490 nm下不同时间的吸光度值。实验共两组，分别为空质粒转染N-2a细胞组、GAL-N-2a稳转细胞克隆组。

N-2a和GAL-N-2a细胞组的周期分析 不同单克隆细胞复苏后达80%以上汇合后以2×103/孔的密度接种于12孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养48～72 h，使细胞贴壁并达到对数生长期时，消化、离心收集细胞，以1 ml的PBS洗细胞两次，加入5 ml 70%预冷乙醇重悬，于4℃固定过夜，同期收获对照组。第2天离心收集细胞，以1 ml的PBS洗细胞1次，每管加入0.5 ml含有碘化丙啶染料200 μl与打孔剂200 μl的染色液，在室温下避光孵育30 min，最后1 h内上机以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2～3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件进行分析，组间比较采用t检验，数据以¯±s表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

阳性细胞克隆的PCR法鉴定 以G418筛选后所得单克隆细胞 (不同单克隆细胞组分别命名为a、b、c、d)基因组DNA为模板进行PCR，结果显示在近3000 bp(理论值为2896 bp)处有一条明亮的带，与目的基因片段的预期位置相符，在非经转染的细胞基因中未扩增出条带 (图1)。

图1 PCR法检测PcDNA 3.1-PDGF-GAL在N-2a细胞的转染结果Fig 1 Identification of products of PcDNA 3.1-PDGF-GAL transfected into N-2a cells cloned by PCR

细胞克隆中转录水平的鉴定 提取稳定转染PcDNA 3.1-PDGF-GAL的GAL-N-2a细胞总RNA，经RT-PCR，N-2a组和GAL-N-2a组均有GAL(500 bp)和内参(250 bp)的表达 (图2)，通过凝胶图像分析软件对电泳条带进行灰度分析，比较目的片段和内参照灰度比值，GAL-N-2a单克隆细胞组分别为1.68±0.12、0.52±0.04和4.14±0.22，N-2a组为0.63±0.13，实验组中有两个单克隆细胞组的甘丙肽表达量明显高于N-2a组 (P＜0.05)。

细胞克隆中GAL表达水平的鉴定 Western blot检测结果显示，在转染的N-2a细胞中表达的甘丙肽蛋白可以被甘丙肽单抗特异性识别，大小与预期相同，相对分子质量约为3200(图3)，通过凝胶图像分析软件对蛋白条带进行灰度分析，比较目的片段和内参照灰度比值，GAL-N-2a单克隆细胞组分别为4.22±0.26、5.36±0.31和5.43±0.34，N-2a组为0.78±0.15，重组质粒转染组GAL表达量明显高于对照组 (P＜0.05)。

图2 RT-PCR检测GAL和GAPDH mRNA在细胞株中的表达Fig 2 Cellular GAL and GAPDH mRNA expressions were detected by RT-PCR

图3 Western blot检测稳定转染PcDNA 3.1-PDGF-GAL细胞内GAL蛋白的表达Fig 3 Expression of GAL protein in N-2a cells stably transfected with PcDNA 3.1-PDGF-GAL plasmids as analyzed by Western blot

内源性过表达的甘丙肽蛋白对N-2a细胞增殖的影响 随着培养时间的延长，相对于对照正常细胞组，实验细胞组中过表达的甘丙肽对N-2a细胞增殖有明显抑制作用，组间比较差异具有统计学意义 (P＜0.05)(表1)。

内源性过表达甘丙肽蛋白对N-2a细胞周期的影响 单克隆细胞a、c和d组GO/Gl期的细胞明显高于空白对照组 (P＜0.01)，其中以单克隆细胞d组最高，达86.75±0.84，同时S和G2/M期的细胞减少(P＜0.01)(表2)。

内源性过表达GAL对N-2a细胞凋亡的影响 应用细胞周期分析方法分析细胞凋亡，结果显示其中1个单克隆细胞实验组出现了凋亡峰 (图4)，凋亡率达(16.01±1.25)%，而对照组无凋亡峰出现。

讨 论

小鼠丙肽由29个氨基酸组成，是羧基末端酰胺化的肽类物质。早期研究表明甘丙肽参与促进神经系统神经 (元)的生长、发育和再生，如在外周痛觉神经损伤后背根神经节甘丙肽表达有较强的上调等，甘丙肽作为脑内重要的神经肽之一，已被证明不但参与许多神经系统的重要功能活动，还具有抗肿瘤作用［4-5］，但在不同组织甘丙肽的作用主要取决于与GALR1-3中不同受体的作用，如在人垂体腺瘤中可同时检测到甘丙肽及其受体GALR1和GALR2基因的mRNA，但是GALR3 mRNA仅出现在手术治疗后又复发患者的垂体腺瘤组织中，这项成果为垂体腺瘤患者的预后提供了重要依据［6］。

表1 两组不同时间点的吸光度值 (n=6，±s)Table 1 Absorbance values in two groups at different time points(n=6，±s)

表1 两组不同时间点的吸光度值 (n=6，±s)Table 1 Absorbance values in two groups at different time points(n=6，±s)

与正常细胞组比较，aP＜0.01aP＜0.01 compared with normal cell group

Group 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h正常细胞组Normal cell group 1.02±0.06 1.12±0.06 2.33±0组别.07 3.08±0.10 2.80±0.08 2.41±0.12单克隆细胞组Monoclonal cell group 1.03±0.06 0.89±0.07a 2.09±0.85a 2.47±0.08a 2.21±0.11a 2.08+0.11a

表2 各组G1、G2和S期细胞所占比例 (n=4，±s)Table 2 G1，G2，and S phases of N-2a cells in different groups(n=4，±s)

表2 各组G1、G2和S期细胞所占比例 (n=4，±s)Table 2 G1，G2，and S phases of N-2a cells in different groups(n=4，±s)

与正常细胞组比较，aP＜0.01aP＜0.01 compared with normal cell group

S phase正常细胞组 Normal cell group 52.37±1.06 15.50±0.21 32.1组别Group G1期G1 phase G2期G2 phase S期4±1.27单克隆细胞a组Monoclonal cell group a 64.01±2.01a 11.09±0.60a 24.90±2.60a单克隆细胞c组Monoclonal cell group c 57.05±1.01a 17.97±0.99a 24.97±0.02a单克隆细胞d组Monoclonal cell group d 86.75±0.84a 10.30±1.43a 2.95±2.26a

图4 各实验组细胞的凋亡率Fig 4 N-2a cell apoptosis rate in different groups

本研究通过绘制细胞生长曲线了解细胞生长规律以保证转染时细胞活力处于最佳状态，转染过程严格按照转染试剂说明书步骤操作及参考相关文献［7］通过调节配制核酸脂质体复合物所用的培养基pH等措施，以携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFPN1进行转染预实验从而获得转染实验最优化参数，如转染时间、细胞汇合度、DNA与脂质体的比例和转染培养基的pH等，为实现GAL在N-2a的相对高效表达提供实验依据。研究证实转染前细胞汇合度达80%～90%，当DNA与脂质体的比例为1∶3，可适当提高DNA-脂质体复合物的利用率，在转染48 h达最佳转染效率，通过对转染培养基pH的调节，当pH分别为7.8时，细胞绿色荧光蛋白阳性率较高，并且对细胞生长情况无明显影响［8］。

本研究先采用LipofectamineTM2000将重组表达质粒转染至N-2a细胞，然后通过G418筛选成功建立了一个在基因组DNA中稳定整合有PcDNA 3.1-PDGFGAL的PDGF-GAL-N-2a细胞克隆。将不同细胞克隆扩增后提取总RNA和蛋白，利用RT-PCR、Western blot检测到N-2a细胞中GAL基因相对于对照组细胞在mRNA和蛋白水平均实现稳定高表达，该细胞株可稳定传代达10次以上。

有研究表明GAL作为一种重要的神经内分泌物质存在于多种神经内分泌肿瘤组织和非神经内分泌肿瘤组织中并参与多种肿瘤的发生发展［9］，例如嗜铬细胞瘤、神经内分泌肿瘤、神经节细胞瘤、垂体腺瘤、胶质瘤等多种人类肿瘤中均检测到上调的甘丙肽样免疫反应 (Gal-LI)的细胞［10］，提示GAL与肿瘤密切相关。本研究无论是转染空质粒后的实验对照组细胞，还是转染重组质粒后获得的单克隆细胞实验组，经RT-PCR和Western blot法均能检测到GAL mRNA和GAL蛋白的表达，其中实验组明显高于对照组。经MTT法测定显示甘丙肽对N-2a细胞增殖有明显的抑制作用。

本研究显示细胞周期异常重启可能是甘丙肽蛋白诱导N-2a凋亡的重要机制。细胞周期是可分裂细胞通过一系列细胞事件实现细胞分化或增殖的过程。真核生物的细胞周期包括Gl期 (DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期 (DNA合成后期)和 M期(分裂期)4个时相。要启动并完成细胞周期，必须有持续的刺激使细胞周期越过检测点，其中最关键的是Gl/S和G2/M两个检测点。本研究用流式细胞术分析细胞DNA含量，显示内源性过表达GAL的N-2a细胞单克隆大部分处于GO/G1期，相比对照组细胞，单克隆细胞有明显的凋亡趋势，这对于甘丙肽在癌症及神经系统类疾病发生发展中的角色和作用有了更进一步的认识。

鉴于可比性考虑，本研究测定内源性过表达甘丙肽对N-2a细胞增殖和凋亡的影响中实验组均系同一单克隆细胞株，经反转录和Western blot表明该单克隆细胞株甘丙肽表达量相对最高。

综上，本研究建立稳定表达甘丙肽的细胞株，实现了外源甘丙肽基因在N-2a细胞的表达，为后续实验中甘丙肽转基因小鼠的制备提供了理论依据;有关内源性过表达甘丙肽蛋白对N-2a细胞增殖、周期和凋亡的初步研究为临床肿瘤治疗提供了理论基础，具有一定的应用价值。然而内源性甘丙肽对N-2a细胞增殖和凋亡的作用具体是通过哪个受体及作用机制尚有待于进一步研究。

(志谢:感谢实验动物中心张引红老师、郭永昌老师、卫兵艳师姐等在学习和科研工作方面给予的指导和帮助。)

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