去乙酰化酶3在胃癌中的表达及其临床意义

丁 瑜，付雪琼，余长寿，杨 兵(广东省深圳市龙岗中心医院消化内科，深圳 586;遵义医学院珠海校区;通讯作者，E-mail:yangbing6708@63.com)

研究发现主要的致癌信号通路最后都会汇聚到肿瘤细胞代谢上来，因为肿瘤细胞的代谢决定着肿瘤细胞的生长和存活，细胞代谢的改变可作为肿瘤的一个重要特点［1，2］。很多研究表明，去乙酰化酶3(SIRT3)在肿瘤细胞代谢中发挥重要作用［3］。SIRT3是沉默信息调节因子相关酶家族(sirtiuns)的一员，显著分布于细胞线粒体中，通过调控细胞葡萄糖的代谢，影响肿瘤细胞的新陈代谢，与肿瘤的发生和发展密切相关［4］。但SIRT3的表达与胃癌的关系尚不清楚，本研究采用Western blot和免疫组织化学的方法检测胃癌组织和癌旁组织中SIRT3的表达情况，并探讨其与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 组织标本

收集深圳龙岗中心医院及深圳市人民医院2012－07～2012－12手术切除且病理资料完整的20例胃癌组织及癌旁组织(距手术切缘2－5 cm处正常胃组织)标本，所取组织置于液氮中保存24 h，后转－80℃冰箱保存，采用Western blot方法检测以上20例组织中SIRT3的表达。另外收集深圳龙岗中心医院2006－03～2007－12手术切除后的胃癌蜡块包埋标本30例，切缘组织为癌旁正常对照组，采用免疫组化方法检测以上50例标本中SIRT3的表达，并分析其与胃癌病理特征的关系。所有标本术前均未行放化疗，且病理诊断明确为胃癌。免疫组化标本中男42例，女8例;年龄 30－82岁，平均年龄(60.9±12.3)岁;按照国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC，2010)胃癌 TNM 分期:Ⅰ－Ⅱ期 22例，Ⅲ－Ⅳ期28例;有淋巴结转移34例，无淋巴结转移16例;高、中分化胃癌24例，低分化胃癌26例。

1.2 材料

SIRT3兔抗人单克隆抗体、鼠抗人单克隆β-actin抗体购自Cell Signaling Technology，免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 Western blot 取保存于－80℃冰箱的组织样本，用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度后加入上样缓冲液，100℃煮沸5－10 min变性，12.5%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，每孔上样总蛋白约30 μg左右，后进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜后加入SIRT3及β-actin抗体，用5%BSA稀释，稀释比例均为1∶1 000，4℃摇床过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1 h，运用ECL试剂盒(Milipore公司)发光、显影、定影、冲洗晾干、拍照并成像分析。

1.3.2 免疫组织化学 采用免疫组化Max Vision二步法，具体步骤严格按免疫组化化学试剂盒说明书进行操作，DAB染色，苏木素复染后中性树胶封片。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，已证实的SIRT3染色阳性的切片作阳性对照。

1.4结果判定

1.4.1 Western blot结果判断 运用 Quantity One软件分析蛋白条带的灰度值，将SIRT3/β-actin的比值作为蛋白表达的相对量。

1.4.2 免疫组化结果判断［5］所有切片采用双盲法由2－3位有经验的病理科医师阅片。SIRT3染色阳性表达位于胞质内，呈清晰棕黄色颗粒。每张切片随机观察5个高倍视野，判断标准根据显色细胞数和显色强度两个方面来评估。按显色细胞数评分:未见显色细胞为0分;细胞显色比例＜50%为1分;细胞显色比例≥50% 为2分。按显色强度计分:无细胞显色为0分，呈淡黄色为1分，呈棕黄色为2分。两者积分乘积＜2分表示阴性，≥2分表示阳性。

1.5 统计学分析

采用 SPSS 17.0软件进行统计学分析，对Western blot检测的蛋白相对表达量运用t检验，免疫组化测定结果进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测SIRT3在胃癌组织中的表达

免疫印迹法结果显示，SIRT3在胃癌中表达阳性率为35%，其在胃癌组织中的表达水平明显低于其对应的癌旁正常胃组织，SIRT3在胃癌中的表达水平(0.960±0.126)较胃癌癌旁组织的表达水平(1.932 ±0.130)比较差异有统计学意义(P＜0.05，见图1)。

图1 Western blot检测SIRT3在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达Figure 1 The expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues by Western blot

2.2 免疫组化检测SIRT3在胃癌组织中的表达

免疫组化染色结果显示，SIRT3在胃癌细胞中的表达主要位于细胞质内(图2)，并且在胃癌组织中的表达阳性率为34%，明显低于癌旁正常胃组织(64%，P＜0.05，见表1)。

图2 SIRT3在胃癌组织及癌旁组织中的表达 (Max Vision法，×200)Figure 2 The expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues by immunochemistry(Max Vision，×200)

表1 SIRT3在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达 (例)Table 1 Expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues (cases)

2.3 SIRT3的表达与临床各病理特征的关系

SIRT3在胃癌组织中的表达与年龄、性别、淋巴结转移无相关性(P＞0.05)，但与浸润深度、分化程度及TNM分期有关(P＜0.05，见表2)。

3 讨论

SIRT3是沉默信息调节因子相关酶家族(sirtiuns)成员之一，sirtiuns家族被认为是Ⅲ类组织蛋白去乙酰化酶(HDAC)，该家族蛋白在进化上高度保守，已经成为对衰老和长寿有重要作用的调控因子，它们通过NAD+依赖的酶催化活性，在细胞代谢、抗逆性、细胞增殖、存活和凋亡等过程起重要作用［6］。SIRT3是线粒体中主要的去乙酰化酶，具有去乙酰基酶活性，定位在11号染色体(11p15.5)，基因长度21 kb，在肌肉、肝脏、心脏和褐色脂肪组织等代谢活动活跃的组织中高表达［7］。研究表明，肿瘤细胞主要通过葡萄糖的有氧糖酵解为细胞增殖、分化提供能量［4］，而SIRT3正是以新陈代谢的许多酶类作为发挥去乙酰化作用的靶点，进而激活有氧代谢路径，影响肿瘤细胞的能量代谢［6］。目前大多数研究认为，SIRT3通过多种细胞代谢通路调控肿瘤细胞的代谢和生长，发挥肿瘤抑制的作用［8，9］。

表2 胃癌SIRT3的表达与临床病理特征的关系 (例)Table 2 The relationship between clinical pathological features of gastric carcinoma and the expression of SIRT3 (cases)

我们的研究结果显示，胃癌组织中SIRT3表达的阳性率明显低于癌旁正常组织，SIRT3在胃癌组织中呈低水平表达。虽然SIRT3在胃癌组织中低表达的机制尚不清楚，但已有研究［8，10］发现，SIRT3 在多种恶性肿瘤，如乳腺癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌和肾透明细胞癌中表达也明显降低。最近Zhang等［11］也通过实验研究发现，SIRT3在原发性肝癌组织中低表达，并且SIRT3的过度表达能抑制肝癌细胞的生长，以上文献研究结果均与我们的研究结论一致。

同时Zhang等还发现SIRT3在肝癌细胞中的表达水平与患者的AFP值、肿瘤多发性、分化程度、临床分期以及有无复发呈显著相关性。为进一步探讨SIRT3在胃癌的发展进程中的作用，我们分析了SIRT3的表达与临床病理因素的关系，我们发现SIRT3的表达与胃癌的浸润深度、分化程度、临床分期有关，浸润胃组织越深，SIRT3的表达越低;分化程度高较分化程度低的胃癌组织中，SIRT3的表达水平较高;临床分期越晚，SIRT3的表达水平越低，其差异均有统计学意义(均P＜0.05)。提示SIRT3的表达与胃癌细胞的侵袭能力、恶性程度有相关性，可能为临床上检测SIRT3的表达水平评估胃癌的恶性程度提供一定的理论基础。

综上所述，SIRT3与胃癌的发生、发展有密切关系，SIRT3在胃癌发生、发展方面可能发挥重要作用，SIRT3的表达与分化程度、浸润深度、临床分期有相关性，检测SIRT3蛋白的表达水平可能作为评估胃癌恶性程度的的一项重要指标。

［1］ Cairns RA，Harris IS，Mak TW.Regulation of cancer cell metabolism［J］.Nat Rev Cancer，2011，11(2):85－95.

［2］ Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation［J］.Cell，2011，144(5):646－674.

［3］ Hirschey MD，Shimazu T，Huang JY，et al.SIRT3 regulates mitochondrial protein acetylation and intermediary metabolism［J］.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2011，76:267－277.

［4］ Bayley JP，Devilee P.The Warburg effect in 2012［J］.Curr Opin Oncol，2012，24(1):62－67.

［5］ 张庆飞，杨兵.Ezrin和 c-Met在胃癌组织中的表达及意义［J］.山西医科大学学报，2012，43(4):257－259.

［6］ Verdin E，Hirschey MD，Finley LW，et al.Sirtuin regulation of mitochondria:Energy production，apoptosis，and signaling［J］.Trends Biochem Sci，2010，35:669－675.

［7］ Jin L，Wei W，Jiang Y，et al.Crystal structures of human SIRT3 displaying substrate induced conformational changes［J］.Biol Chem，2009，284(36):24394－24405.

［8］ Kim HS，Patel K，Muldoon-Jacobs K，et al.SIRT3 is a mitochondria-localized tumor suppressor required for maintenance of mitochondrial integrity and metabolism during stress［J］.Cancer Cell，2010，17(1):41－52.

［9］ Finley LW，Carracedo A，Lee J，et al.SIRT3 opposes reprogramming of cancer cell metabolism through HIF1α destabilization［J］.Cancer Cell，2011，19(3):416－428.

［10］ Schumacker PT.A tumor suppressor SIRTainty［J］.Cancer Cell，2010，17(1):5－6.

［11］ Zhang CZ，Liu L，Cai M，et al.Low SIRT3 expression correlates with poor differentiation and unfavorable prognosis in primary hepatocellular carcinoma［J］.PLoS One，2012，7(12):e51703.