20S蛋白酶体表达与类风湿关节炎的关系探讨

吕晓虹 李伟 何岚 王怀宇 蒲丹 孙怡宁 周文旭

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis ,RA)是一种以对称性、侵蚀性关节滑膜炎为特征的慢性、系统性自身免疫疾病, 炎症为RA发病机制的中心环节。泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway , UPP)是真核细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径, 20S蛋白酶体是UPP中具有蛋白酶催化活性的核心颗粒。UPP通过调控多种炎症调节蛋白, 在炎症过程中发挥着重要作用［1］。研究显示RA患者血清蛋白酶体及其自身抗体浓度升高, 蛋白酶体抑制剂可缓解关节炎大鼠病情进展［2］, 提示蛋白酶体参与了RA的发生、发展。关节滑膜中炎症浸润细胞主要来源于外周血细胞［3］, 循环单核细胞在RA发病机制中具重要作用［4,5］。RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)是否存在蛋白酶体表达及功能异常目前尚未见报道, 本课题通过检测RA患者20S蛋白酶体蛋白表达水平, 对该问题进行了初步探讨。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 临床确诊的RA患者30例, 来自西安交通大学第一附属医院风湿科住院患者, RA诊断参照1987年美国风湿病协会分类诊断标准。健康对照28例, 来自西安交通大学第一附属医院体检中心健康体检人员, 排除自身免疫病性疾病。两组研究对象均排除心、脑、肝、肾疾病；急、慢性感染；恶性肿瘤等疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 一般临床资料 记录所有研究对象性别、年龄, RA患者记录病程, 检测类风湿因子、C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、红细胞沉降率(ehythrocyte sedimention rate,ESR)、自身抗体, 计算发病时的疾病活动性评分DAS28。

1.2.2 PBMC的分离与纯化 取受试者空腹外周静脉血5 ml,加肝素钠抗凝(3.8 μl/ml)。采用淋巴细胞分离液(上海华精)密度梯度法分离PBMC。

1.2.3 20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达测定 采用Western印迹法测定PBMC中20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达水平。RIPA裂解液裂解PBMC, 吸取上清液获细胞蛋白裂解液。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电转印至NC膜。5%BSA封闭液,37℃封闭NC膜1 h。分别加入稀释的一抗：proteasome 20S C2 Rabbit Ab (1:1000, Abcam), Rabbit Anti-β-actin(1:400, 北京博奥森), 4℃过夜。TBST洗膜5 min×3次, 加入稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1:8000, 北京博奥森), 37℃孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次。等比例混合ECL发光液(Pierce Biotechnology), NC膜孵育5 min, 曝光, 凝胶成像分析系统成像保存。所得图像导入Quantity One生物医学图像分析系统进行图像分析处理, 蛋白含量以条带的积分光密度值表示。目的条带和内参照β-actin条带IOD值的比值为目的片段的光密度比值, 表示检测蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 一般临床资料 RA患者30例(男性3例, 女性27例),年龄 (46.67±11.97)岁, 病程(6.96±3.65)年, ESR (50.55±35.02)mm/h, CRP (27.82±23.10 )mg/L, RF (90.72±74.60 )IU/ml,DAS28评分(4.89±1.60)。健康对照30例(男性5例, 女性23例), 年龄 (41.04±11.17)岁。RA与正常对照之间年龄差异无统计学意义。

2.2 20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达 20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达水平用Western-Blot灰度值表示(图1)。RA患者PBMC中20S蛋白酶体C2亚基表达水平高于正常对照组［(2.92±1.41)VS (0.65±0.42), P<0.01)］差异具有显著统计学意义。

图1 Western-Blot检测20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达, 以β-Actin作为内参照

2.3 相关性分析 分别对RA患者20S蛋白酶体C2亚基表达与DAS28、CRP、ERS指标进行相关性分析, 结果显示RA患者蛋白酶体C2亚基表达水平与DAS28、CRP、ERS之间无显著相关性。

3 讨论

UPP是真核生物细胞中一种高效的蛋白分解途径, 具广泛的生物学作用。蛋白酶体是依赖ATP的蛋白水解酶复合物,是真核细胞中分解内源性蛋白质的主要酶系统, 也是UPP的核心部分。蛋白酶体由20S蛋白酶体和调节颗粒组成, 主要降解一些短寿命的蛋白、变性蛋白、癌基因产物蛋白等, 对维持细胞稳态和生物学效应起到了重要作用, 也参与了免疫炎症反应的调节［1］。

UPP与疾病关系的探讨是目前研究的热点, 其功能异常与多种人类疾病相关, 包括自身免疫病和炎症［6］。研究发现,在系统性红斑狼疮(SLE)、原发性干燥综合症(PSS)、强直性脊柱炎(AS)、类风湿性关节炎(RA)、多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)等多种结缔组织病中存在着蛋白酶体的异常［7,8］。上述研究主要集中在血清蛋白酶体或其抗体的检测。

RA关节滑膜中炎症浸润细胞主要来源于外周血白细胞,PBMC可反映整体的炎症状态［9］, 而UPP通过调控多种炎症调节蛋白在炎症过程中发挥着重要作用。因此, 观察RA患者PBMC中蛋白酶体的变化对于探讨蛋白酶体在RA 发病机制的作用具有重要意义。本研究首次发现RA患者PBMC中20S蛋白酶体C2亚基表达水平显著高于正常人群, 具统计学差异。该结果进一步证实了蛋白酶体与RA的发生具有密切联系, 但其在RA发病机制中的具体作用还有待进一步研究。

随着对UPP病理生理作用的深入研究, 蛋白酶体抑制剂的临床应用和开发受到日益重视。蛋白酶体抑制剂bortezomib已经用于对多发性骨髓瘤的临床治疗, 并显示了其有效性。基于蛋白酶体抑制剂强大的抗炎、抑制细胞增殖及促进凋亡的作用, 有学者提出其在RA等炎性疾病的治疗中具有良好的应用前景［2,5］。体外和动物实验证实蛋白酶体抑制剂可抑制活化的T细胞释放炎症因子［10］缓解关节炎大鼠的病情进展［2］, 但是否可真正应用于临床患者还需要大量的研究。本研究为应用蛋白酶体抑制剂治疗RA提供了一定的理论依据。

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