参麦注射液对脓毒症模型大鼠肾脏细胞凋亡和Bcl-2/Bax 蛋白表达的影响

林梅瑟 叶 帆 浙江省温州市中医院ICU 温州 325000

赵志光 温州医学院附属第二医院病理科

脓毒症是由感染所致的全身炎症反应综合征，是危重患者主要的死亡原因，也是重症医学面临的主要焦点和难点。一项多中心大样本的回顾性研究显示，42.1%的脓毒症患者并发急性肾损伤（acute kidney injure，AKI），脓毒性AKI 患者病情更危重、病死率更高；脓毒性AKI 是高病死率及长住院时间的独立影响因素[1]。参麦注射液在临床上广泛应用于危重病患者的救治，有报道参麦注射液对脓毒症患者的肝、肾、心功能有保护作用[2]。本研究采用盲肠结扎穿刺法（cecal ligation puncture，CLP）制备大鼠脓毒症模型，观察参麦注射液对脓毒症大鼠肾脏细胞凋亡影响，现报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 健康清洁级雄性Sprague-Dawley 大鼠45 只，体质量280～350g，由温州医学院动物实验中心提供，动物合格证号SYXK（浙）2005-0061。

1.2 药物和试剂 参麦注射液（规格：10mL/支，批号1110201，正大青春宝药业有限公司）；Bcl-2、Bax 免疫组化试剂盒（批号MAB-0014、MAB-0254，福州迈新生物技术有限公司）；二抗为抗鼠IgG 聚合物；DAB 试剂盒（批号12120743F，福州迈新生物技术有限公司）；大鼠肾脏细胞凋亡试剂盒（批号DMK500，宝生物工程大连有限公司）。

2 实验方法

2.1 模型制备及分组 45 只大鼠随机分为假手术组、脓毒症模型组和参麦组，每组15 只。采用盲肠结扎穿刺法（CLP）造模：大鼠术前在标准饲养条件下适应1 周，腹腔内注射10%水合氯醛麻醉（3.5mL/kg），腹壁正中切开2cm，拉出盲肠后在盲肠总长度50%处结扎，用针头在结扎线下5mm 处贯穿盲肠1 次，造成2 个漏口，回纳盲肠后关腹。假手术组除不结扎和穿刺盲肠外，其余操作同脓毒症模型组。脓毒症模型组CLP 造模前1h 腹腔内注射生理盐水10mL/kg，参麦组CLP 造模前1h 腹腔内注射参麦注射液10mL/kg。三组大鼠术后立即皮下注射50mL/kg 林格氏液抗休克治疗。

2.2 标本采集 于术后24h 予10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔内注射麻醉大鼠，打开腹腔，分离肾脏，将一个肾脏组织迅速放入10%甲醛溶液中固定，送病理室切片做玻片制备，另一肾脏组织迅速置于冷冻管中，液氮保存待用。

2.3 肾脏细胞凋亡检测 采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记法（TUNEL 法）检测肾脏细胞凋亡。严格按试剂盒操作：将石蜡切片脱蜡，梯度乙醇水化；蛋白激酶K 消化后PBS 冲洗；过氧化氢阻断后PBS 冲洗；TUNEL 反应液37℃60min后PBS 冲洗；DAB/H2O2显色；苏木素复染；脱水、透明、封片。正常肾脏细胞核呈蓝色，而凋亡阳性肾脏细胞核呈棕黄色。每张切片在光学显微镜200 倍视野下分别随机选择10 个区域，每个区域计数100 个细胞，计算肾脏细胞凋亡指数（apoptosis index，AI），其公式为AI=凋亡细胞数/总观察细胞数×100%。

2.4 肾脏细胞Bcl-2 与Bax 蛋白表达 采用免疫组化检测。肾脏标本用10%中性甲醛固定24h 后行常规石蜡包埋、切片，贴附于涂有多聚氨酸的载玻片上，二甲苯和乙醇脱蜡。切片脱蜡后阻断内源性过氧化物酶，修复抗原，以羊血清工作液封闭,室温孵育10min，然后分别加入Bcl-2 与Bax 抗体，生物素标记二抗，DAB 显色，苏木精复染，脱水、透明、封固，光镜下观察。细胞浆中有棕黄色颗粒者为Bcl-2、Bax蛋白阳性表达细胞。每张切片在光学显微镜200 倍视野下分别随机选择10 个区域,每个区域计数100个细胞，计算Bcl-2、Bax 蛋白阳性表达细胞百分比。

2.5 统计学方法 应用SPSS11.5 统计软件处理数据。计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；凋亡指数及Bcl-2 与Bax 采用非参数成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis H 法），组间两两比较用Mann-Whitney U 检验。计数资料用率或频数表示，采用χ2检验。

3 实验结果

3.1 三组大鼠体质量比较 造模型时脓毒症模型组死亡6 只，参麦组死亡4 只，假手术组无死亡。三组大鼠体质量比较差异无统计学意义（F=0.187，P=0.829），见表1。

表1 三组大鼠体质量比较（） kg

表1 三组大鼠体质量比较（） kg

3.2 大鼠肾脏细胞凋亡 三组均可见肾脏细胞凋亡，细胞凋亡多发生于肾小球细胞。脓毒症组和参麦组肾脏细胞AI 均高于假手术组（P＜0.01），参麦组肾脏细胞AI 虽低于脓毒症组，但差异无统计学意义（P=0.084），见表2。

3.3 大鼠肾脏Bcl-2 和Bax 蛋白表达 免疫组化结果显示，与假手术组比较，脓毒症组和参麦组肾脏细胞Bcl-2 表达下降（P＜0.01，P＜0.05），Bax 表达上调（P＜0.01），Bcl-2/Bax 比值减小（P＜0.01）。与脓毒症组比较，参麦组Bcl-2 明显上调（P＜0.01），Bax 表达下调（P＜0.05），Bcl-2/Bax 比值增大（P＜0.01），见表2。

表2 三组大鼠肾脏细胞AI、Bcl-2和Bax 表达量比较（） %

表2 三组大鼠肾脏细胞AI、Bcl-2和Bax 表达量比较（） %

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与脓毒症组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

4 讨论

脓毒症细胞存在多条细胞凋亡的信号途径，其中线粒体途径是其最重要的途径之一[3]。Bcl-2 和Bax蛋白是该途径的重要调节因子，而Bax 蛋白具有促进凋亡作用，Bcl-2 蛋白起抑制凋亡的作用。

脓毒症是ICU 患者发生ARF 最常见的原因，其发病机制复杂，目前比较关注的是细胞凋亡在脓毒症肾损害中的作用。国内学者研究CLP 脓毒症大鼠发现，脓毒症出现后大鼠肾功能损坏、肾小管上皮细胞凋亡，免疫组化检测Bax 蛋白表达上升，Bcl-2/Bax下降[5]。另有研究发现增加Bcl-2 表达、抑制Bax 表达，上调bcl-2/Bax 比值，可以减少细胞凋亡[6-7]。因此，抗凋亡措施可能对脓毒症肾功能起保护作用。新近在对软骨细胞研究显示参麦注射液可能通过降低促凋亡基因BaxmRNA 表达，增加凋亡抑制基因Bcl-2mRNA 的表达，从而调节Bcl-2/BaxmRNA 的比例，抑制凋亡[8]。

参麦注射液是人参与麦冬制成的中药制剂，其有效成分为人参皂苷、麦冬皂苷、麦冬黄酮及微量人参多糖和麦冬多糖，具有养阴生津、补心复脉、益气固脱之功效，是目前对休克、心衰等急症常用的中药急救制剂。研究[9]发现，参麦注射液使脂多糖致脓毒症大鼠的血清TNF-α 水平下降，肝、肾、肺组织SOD活性增强，肝、肾功能得到保护。在CLP 模型脓毒症大鼠研究发现参麦注射液可显著降低脓毒症大鼠血清促炎性递质和CRP 水平，对脓毒症具有保护作用。俞兴群等[10]研究显示，参麦注射液能显著降低全身炎症反应综合征（SIRS）气虚血瘀证患者的C-反应蛋白、肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8）水平，有效阻止SIRS 的发展与恶化。参麦注射液对脓毒症肾脏细胞凋亡抑制作用未见相关报道。本研究显示，参麦注射液可以显著上调脓毒症大鼠肾脏细胞Bcl-2 蛋白表达、下调Bax 蛋白表达，从而对凋亡基因起调控作用。虽然注射参麦与生理盐水的脓毒症大鼠肾脏凋亡指数比较差异无统计学意义（P=0.084），但参麦组凋亡指数已呈下降趋势。由于本研究实验动物数量有限，有待扩大样本进一步明确参麦注射液对脓毒症大鼠肾脏细胞凋亡抑制作用。

［1］Bagshaw SM，George C，Bellomo R，et al.Early acute kidney injury and sepsis：a multicentre evaluation［J］.Crit Care，2008，12（2）：R47.

［2］黄增峰，陈如康，黄学仄，等.参麦注射液对脓毒症患者器官功能保护作用的临床研究［J］.中国中西医结合急救杂志，2010，17（5）：282-284.

［3］Buerke U，Carter JM，Schlitt A，et al.Apoptosis contributes to septic cardiomyopathy and is improved by simvastatin therapy［J］.Shock，2007，29（4）：497-503.

［4］王茹，张俊录，李月红，等.细胞凋亡及Bcl-2 和Bax 基因表达在脓毒症大鼠肾脏损伤中的作用［J］.实用医学杂志，2011，27（7）：1164-1166.

［5］尹海燕，何志捷，王吉文，等.谷氨酰胺对脓毒症大鼠心肌细胞Bcl-2/Bax 表达的影响［J］.中华急诊医学杂志，2009，18（10）：1037-1042.

［6］邓宇琚，谭宁，曾红科，等.脑利钠肽预处理对在体大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax 表达的影响［J］.中华医学杂志，2010，90（48）：3431-3434.

［7］谢国平，江志强.参麦注射液对加入IL-1β 诱导下软骨细胞Bcl-2/Bax mRNA 表达的影响［J］.中华中医药学刊，2012，30（2）：361-371.

［8］李蓉，黄培春，陈文丽.参麦注射液对脓毒症大鼠多器官损伤的保护作用［J］.中国中医急症，2005，14（12）：1207-1208.

［9］郭海雷，赵遵江，方林森，等.参麦注射液对脓毒症保护作用的实验研究［J］.现代中西医结合杂志，2008，17（35）：5431-5433.

［10］俞兴群，侯勇，李远思，等.益气活血法为主治疗全身炎症反应综合征的临床研究［J］.中国中西医结合急救杂志，2010，17（2）：73-75.