二甲基亚砜对离体猪皮肤组织的拉曼光谱的影响＊

钟会清，刘智明，倪艺榕，熊红莲，郭周义

(华南师范大学生物光子学研究院，激光生命科学教育部重点实验室和中医药与光子技术国家中医药管理局三级实验室，广东广州 510631)

0 引言

拉曼光谱技术(Raman)是从物质的分子振动光谱来识别和区分不同的物质结构的一种技术，具有快速、简单、无损、准确等优点，已成为研究物质分子结构的重要手段，被公认为是研究分子结构和功能的有效方法之一［1］。由于拉曼光谱对生物组织病理微小的分子和结构的变化有很好的敏感性，很高的空间分辨率，不会导致自发荧光和光漂白作用，对水不敏感，样品易准备等特性，使得拉曼光谱技术能应用于检测人体组织结构、生理或疾病状况，从而在分子水平上预测、诊断人体的健康状况(包括各种癌症)已成为物理学家与医学家梦寐以求的愿望［2-5］。国内外学者已广泛开展了拉曼光谱在人体组织，包括各种组织癌变［6-9］、血液［10-12］、皮肤疾病［13-15］等的检测与诊断。然而，由于各种生物组织具有高散射性，因此不利于对深层组织的成像，使得拉曼光谱技术只能用于浅表组织区域。

为了改善光在组织中的渗透深度，多重散射必须降低。在1997年俄罗斯Tuchin研究小组利用近红外光谱仪检测了光透明剂作用后眼球组织，发现光透明及对反射光强的减少起作用，进而推断光透明剂具有控制组织光学参数的作用［16］。随后很多光学仪器被用来检测光透明物质对其光学特性的影响，例如:光学相干层析成像技术(Optical coherence tomography，OCT)［17，18］，二次谐波成像［19］，近红外光谱技术［20］等。本论文采用光透明剂---二甲基亚砜对拉曼光谱光学特性的影响进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料和样品的制备

新鲜猪皮组织(未去脂肪)来自合格的宰猪场，实验样品经蒸馏水清洗和除毛处理后，密封(防止自然失水)后保存在4℃的环境下不超过12 h，并在实验前将样品置于常温下30 min，然后进行实验。为了防止皮肤组织样品在实验过程中自然失水导致皮肤形态和性质发生变化，实验中皮肤组织保持表皮朝上置于培养皿中，并在培养皿中注入磷酸盐(Phosphate buffer saline，PBS)缓冲液，使皮肤样品下端浸入PBS缓冲液，同时表皮暴露在空气中。共切15个面积为2.5 cm ×2.5 cm，平均厚度为(2.0 ±0.65)cm的组织，在处理前和处理后的10 min，20 min，30 min，60 min都利用显微共聚焦拉曼光谱仪进行检测。

pH7.4 的 PBS溶液的配制:将 1.0 g KCl，40 g NaCl，1.2 g KH2PO4，18.16 g NaHPO4.12H2O(以上四种试剂均由天津市福晨化学试剂厂生产)，溶于400mL双蒸水中，并调至 pH7.4，最后定容至500mL，得到10×PBS母液。使用前稀释10倍即得1×PBS溶液，置于室温下保存备用。

二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，浓度为100%)是购于天津市大茂化学试剂厂生产。本实验选用的5%DMSO是按照100%DMSO与蒸馏水按体积5∶95的比例配制的。

1.2 实验仪器

本实验选用Renishaw inVia Reflex型显微共聚焦拉曼光谱仪(英国Renishaw公司)，20倍镜头，波长为785 nm的半导体激光器作为激发光源，其到达样品上的功率约50 mW，积分时间10 s，采集次数2次，光谱波数范围为385～1539 cm-1，采用背向接收的方式采集样品的拉曼信号。

1.3 统计学处理方法

采用Origin数据分析处理软件及inVia Reflex型显微拉曼光谱仪自带的分析处理软件WIRE3.2对数据进行累加处理及谱峰分析。

2 实验结果及讨论

2.1 猪皮肤组织和DMSO的拉曼光谱

在图1(A)中854 cm-1为脯氨酸吡硌环C-C键振动峰，937 cm-1拉曼峰归属于猪皮组织中分子的C-C建骨架的伸缩振动，1003 cm-1拉曼峰归属于猪皮组织中苯基苯丙氨酸等。图1(B)为DMSO的拉曼光谱的谱图，其主要特征峰有680 cm-1，为 C-S伸缩谱;1014 cm-1、1419 cm-1处分别为S-O伸缩谱和CH3的振动谱，因为这两个信号易受猪皮峰影响，而680 cm-1信号很强，因此之后我们对680 cm-1来观察其在皮肤组织的渗透情况，以及对皮肤组织937 cm-1和1003 cm-1来观察DMSO对皮肤组织的光透明性质的变化。

Fig.1 (A)Raman spectrum of porcine skin;(B)DMSO between 395 and 1539 cm-1.The dashed lines indicate the spectral signatures for the porcine skin and the spectral signature for DMSO.680 cm-1is the most different spectral signature comparing DMSO with porcine skin图1 (A)和(B)分别为猪皮组织和DMSO在385～1539 cm-1区域的谱图，其中虚线标注了皮肤的特征峰和DMSO，其中在(B)680 cm-1是DMSO与猪皮组织区别最大的特征峰

Fig.2 Raman spectra of porcine skin at(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm after topically application of 5%DMSO at different time intervals图2 离体猪皮肤组织经5%DMSO处理前、后在不同时间(0 min，10 min，20 min，30 min，60 min)及不同深度(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm 的拉曼光谱的变化

2.2 DMSO作用于离体猪皮肤组织前后的不同深度的拉曼光谱的变化

为了研究DMSO对猪皮组织拉曼光谱的影响及其随时间的变化，我们对经5%DMSO处理前(0 min)和后10 min，20 min，30 min，及60 min的猪皮不同深度(100μm，200μm，300μm，400μm)的拉曼光谱进行比较(如图2)。从图中发现，总趋势是:皮肤组织的拉曼光谱强度随着检测深度的增加而逐渐降低，信噪比也逐渐降低。在表面下400μm处0 min时，其拉曼信号强度非常小，图像信噪比也很低，937 cm-1和1003 cm-1处的峰几乎被荧光背景所覆盖。在经5%DMSO溶液处理之后，拉曼峰937 cm-1和1003 cm-1，的强度比处理前有了很大程度的改善，图像信噪比也明显提高了。此外，在没有施加5%DMSO前在拉曼谱图上消失拉曼峰1126 cm-1和1426 cm-1在施加5%DMSO后又重新出现。同时图2(a-d)显示，各层随着处理时间的加长，5%DMSO对猪皮组织的拉曼光谱的效果也不断的改善，其中在处理后60 min时，是各层拉曼信号最强。

2.3 DMSO作用于离体猪皮肤组织前后在不同深度其几个峰强的变化

为了更好的分析5%DMSO对猪皮组织的拉曼光谱的影响，我们对图2进行了进一步的量化比较，统计了皮肤组织在施加5%DMSO前、后(10 min，20 min，30 min，60 min)时距皮肤表面以下不同深度处各个主要特征拉曼峰(680 cm-1，937 cm-1和1003 cm-1)强度的变化。图3显示:各层在经5%DMSO处理后猪皮组织的各个峰及DMSO的特征峰的强度随着时间的推移而不断增强，并在60 min时强度达到最大。

Fig.3 The Raman peak intensities of porcine skin at(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm corresponding to the Raman spectra in Fig.2，The line styles represents a characteristic peak of the DMSO(680 cm-1)and porcine skin Raman spectra(937 cm-1and 1003 cm-1)，respectively图3 分别表示DMSO(680 cm-1)和猪皮组织(938 cm-1，1003 cm-1)的特征峰在与图2相对应的(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm 不同层随时间的变化情况

3 结论

通过对离体猪皮组织不同深度经5%DMSO处理前、后不同时间的拉曼光谱进行分析研究，以及对猪皮组织的拉曼光谱随时间变化进行了实时监测，发现猪皮组织的拉曼光谱在处理后的60 min效果最好。结果表明:5%DMSO处理后的猪皮组织的拉曼光谱的信噪比有很大的提高，各特征峰的强度相对于处理前也有非常大的增强。这种增强效果几乎是随着施加5%DMSO的时间增加而加强。

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