不同人胚胎干细胞系向限定性内胚层分化能力存在差异＊

李 进，贺菁菁，林 戈，卢光琇*

(1.中南大学生殖与干细胞研究所，湖南长沙 410078;2.人类国家干细胞工程研究中心，湖南长沙 410078)

人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells，HESCs)是来源于囊胚内细胞团的一群多能性细胞，由于其具有向三个胚层的所有细胞分化的能力以及在体外无限扩增的特点，自从1998年首次成功分离后，就一直作为再生医学的重要种子细胞被广泛的研究。然而，越来越多的证据显示不同的HESCs之间存在分化能力的差异［1，2］。2008 年 Osafune K［3］研究发现不同的HESCs具有不同的胚层分化能力，有些细胞系很难分化得到内胚层和中胚层细胞。上述结果提示对单个HESCs而言，是否存在分化能力的倾向性而不能用于治疗多种疾病。不同的细胞系之间是否真正的存在分化能力上的差异需要去验证。

由于在HESCs培养和诱导分化过程中都是使用同一的处理条件，这种差异很有可能在HESCs阶段就已经决定了。尽管HESCs表达绝大多数的共性表达的基因，但是每个细胞系也有自己唯一的基因表达特点［4］。C.Allegrucci等［5］研究结果显示不同的人胚胎干细胞系之间在基因转录组和表观遗传学上存在差异。运用染色质免疫共沉淀联合测序技术(ChIP-Seq)对转录因子检测可以预知不同细胞系之间的差异基因表达［6］。这些在HESCs阶段的差异是否与随后的向特定谱系的分化能力的差异相关联值得进一步的探讨。

本实验利用已经建立的HESCs细胞库［7］资源和人胚胎干细胞向限定性内胚层分化平台［8］，系统比较10株HESCs在诱导分化效率上是否存在差异，并尝试寻找差异存在的原因。

1 材料与方法

1.1 胚胎干细胞来源与培养.

随机选取人类干细胞国家工程中心提供的10株人胚胎干细胞系，在CF-1饲养层上培养扩增培养。每隔6-7天传代一次，DF-ES培养基配方为，基础培养基 DMEM/F12，15%SR，0.1 mmol/L β-ME，2 mmol/L L-Glu，4 ng/mL bFGF，1% 非必需氨基酸。

1.2 拟胚体(EB)分化实验

HESCs在饲养层细胞上生长5-7天后，使用机械切割的方式，将HESCs克隆切割成大小相对均一的方块，用200μLTip头将方块吹起，并转移到60 mm的细菌培养皿中悬浮培养形成拟胚体，使用的DFEB培养基和DF-ES培养基相比，缺少bFGF因子，其余成分和比例一样。

1.3 ActivinA和 Wnt3a共同作用诱导限定性内胚层

在Matrigel铺皿的无饲养层体系上培养hESCs，培养至融合度大于80%时，去除分化细胞，用DPBS洗2～3遍，开始诱导实验，诱导过程中基础培养基为RPMI1640。诱导第1天，联合Activin A(100 ng/mL)和Wnt3a(25 ng/mL)共同作用1天。第2天，使用Activin A(100 ng/mL)和 FBS(0.2%)作用一天。第3天，使用ActivinA(100 ng/mL)和FBS(2%)作用一天。经历3天的诱导获得Sox17阳性的限定性内胚层细胞。

1.4 免疫荧光染色

收集HESCs和分化后的限定性内胚层细胞用PBS洗去细胞中的培养基，添加4%的多聚甲醛溶液室温下固定细胞30min，PBS清洗3遍，加封闭液(PBS中添加10%驴血清、0.1%的 triton-X-100和1%BSA)处理30 min，PBS清洗3遍，加入Oct4(小鼠抗人 Oct4单克隆抗体，1∶40稀释，Santa Cruz)，Sox17(山养抗人Sox17，1∶50稀释，R＆D)4度孵育一抗过夜。次日，PBS清洗3遍，加荧光二抗(驴抗羊Alexis 594，1∶1000;驴抗小鼠 Alexis 488，1∶1000)室温避光孵育1 h，PBS清洗3遍，添加DAPI(1∶1000稀释)染核，室温避光孵育5 min，用 PBS清洗2遍，Nikon荧光显微镜下观察结果。

1.5 流式细胞仪计数SSEA-4和Sox17阳性比率

收集HESCs和分化后的限定性内胚层细胞用PBS洗去细胞中的培养基，每孔加入1mL accutase消化3min使HESCs成单细胞悬液，使用FBS buffer(DPBS+3%FBS)重悬并计数每孔细胞数目。细胞在Cytofix/cytoperm buffer(BD)固定过夜。选取1×105细胞每样本开始实验，添加 SSEA4-PE(BD)到HESCs中，添加Sox17-APC(BD)到分化后的限定性内胚层细胞中，4度孵育30 min到1 h，接着用FBS buffer洗3遍并重悬到400μL每样本上样检测。

1.6 基因表达谱分析

选取 chHES8，chHES90，chHES45，chHES26四株sox17阳性率差异较大的细胞系抽提RNA，送样检测这些细胞系的基因表达谱。芯片版本为Human Genome U133 Plus 2.0 Gene Chip arrays，由北京博奥提供技术服务。应用GCOS软件进行数据读取，聚类分析由cluster 3.0软件操作经Java TreeView读取聚类图，差异基因由SAM(Significance Analysis of Microarrays)软件分析获得。对筛选基因进行的热图通过MultiExpiments Viewer(Mev)软件分析获得。

1.7 realtime PCR

收集细胞并用 TRIZOL抽提 RNA。取1μg总RNA参照Promega公司试剂说明书进行逆转录操作，所得cDNA放置-20℃保存或继续行PCR扩增目的基因。Realtime PCR检测差异细胞系中MEG3和SNORD114-3的表达，同时扩增28 S作为内参。反应体系如下:PCR SYBRGREEN，10μL;引物，2μL;cDNA 模板，8μL;总体积，20μL。

2 结果

2.1 不同细胞系在EB分化中存在差异

为了验证不同细胞系在分化能力上出否存在差异，随机选取6株HESCs进行EB分化实验，分别在d1，d3，d5和d7天观察这些细胞的分化形态，结果不同细胞系呈现两种不同的发展趋势，一类细胞系像chHES90和chHES8随着分化的时间推移，EB团块能迅速增殖而且维持紧密状态。而另一类细胞系像chHES26和chHES45随着分化的时间推移，EB团块越来越少，在day7只能检测到极少数的团块(图1)。简单的EB分化实验说明，不同的细胞系在多能性维持和分化能力上确实存在差异。

图1 不同HESCs间EB分化7天形态变化图Fig.1 The morphologic change gram of 7 days EB differentiation between HESCs

2.2 不同细胞系向限定性内胚层分化过程中存在差异

上述结果中说明不同的HESCs存在的分化能力上的差异，为了进一步了解这些细胞系向特定谱系分化能力的差别，通过定向诱导分化为Sox17阳性的限定性内胚层细胞(图2)，比较Sox17阳性细胞比率的差异。发现尽管在起始阶段细胞都维持着相对的均一性(SSEA4均维持在90%以上的阳性细胞)，经过3天的诱导分化后，Sox17的阳性比率在这些细胞系中在60%～80%范围内波动，结果说明不同的细胞系存在着向限定性内胚层诱导分化能力的差异(图3)。

图2 诱导不同阶段的免疫染色结果Fig.2 The immunostaining results on different stage

图3 不同细胞系间SSEA4和Sox17流式检测结果Fig.3 The FACS result of SSEA4 and Sox17 between HESCs

2.3 不同细胞系基因表达谱分析结果

在向限定性内胚层诱导分化过程中，像Sox17和cxcr4等基因相对于HESCs有上调超过10倍以上的差异［9］。为了找寻这些细胞系存在差异的原因，选取了Sox17表达差异的明显的细胞系检测基因表达谱。重点关注这些在限定性内胚层中高表达的基因在不同的HESCs之间的表达情况，发现这些基因在差异细胞系中没有明显差异，表达值的差异倍数小于2倍(图4)。有可能这些基因在HESCs起始状态下还是处于一个预备启动的状态，并没有完全活化。进一步寻找差异基因，发现像MEG3和SNORD114-3在差异细胞系之间和同株细胞早晚期代数之间存在表达差异(图5)。realtime PCR验证结果中除了chHESC8以外，其余的三株细胞系中这两个基因在早期代数比初期代数下降非常显著(图6)。

图4 内胚层高表达基因在不同HESCs之间的表达情况Fig.4 The expression of genes higher expressed in definite endoderm between HESCs

图5 MEG3和SNORD114-3在不同细胞系中的表达情况Fig.5 The expression of MEG3 and SNORD114-3 between HESCs

3 讨论

不同的HESCs确实存在着向限定性内胚层细胞诱导分化能力的差异，胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的对比分析发现，Sox17和Foxa2的表达水平在诱导性多能性干细胞来源的限定性内胚层中要高于胚胎干细胞来源的限定性内胚层细胞［10］。尝试寻找这些分化差异存在的原因，不仅能回答HESCs是否具有真正意义上的全能性，更能为诱导分化提供更多的改进和优化的信息。

图6 Realtime PCR检测MEG3和SNORD114-3在不同细胞系中的差异表达Fig.6 The difference expression of MEG3 and SNORD114-3 between HESCs by realtime PCR

关于干细胞基因表达谱的研究发现［11-13］，胚胎干细胞相比体内其它干细胞或终末分化细胞表达更多的基因，许多在分化细胞中表达的基因在胚胎干细胞都有微弱的表达。通过对比7株HESCs的表达谱发现，尽管整体上这些细胞系的基因表达是相似的，但是每个系具有自己差异表达的基因，而这些反应了自己的遗传差异性并和可能的分化潜能相联系［14］。Lars Palmqvist研究也提示比较不同细胞系的基因表达谱的差异与其多能性的评估之间存在相互关联［15］。这四个细胞系的基因表达谱的对比分析结果中，在限定性内胚层细胞中高表达的基因在起始阶段没有超过2倍以上的表达差异，提示可能还有其他层面和途径来调控这些差异的存在。

除了内在的特性影响到HESCs分化能力的差异，还有外在的干预因素也会影响到分化的差异［16］。MEG3和SNORD114-3属于非编码的小RNA参与基因的表达调控，并能参与到诱导性多能性干细胞的全能性调控［17］。结果中显示 MEG3和 SNORD114-3在差异细胞系之间和同株细胞早晚期代数之间存在表达差异，这些差异与干细胞的分离时间段和培养过程所造成的表观遗传学修饰差异相关，可能是造成内胚层分化能力差异的原因。关于HESCs的表观遗传学调控发现［18-20］，关键的发育相关基因大多数都受高度保守的序列所调控，在HESCs中存在着“bivalent domains”保证这些基因处于表达的“引导状态”，有利于接受外界的信号马上启动表达。关于这些非编码小RNA调控差异的机制还需要更进一步的探索研究。同时，有研究比较了5株细胞系向造血分化潜能［21］，提示可以考虑比较这些细胞系限定性内胚层细胞接着向胰腺或者肝脏的分化差异，试图找到更多的调控差异的因素。此外，通过这样的比较，筛选出向内胚层分化能力有优势的人胚胎干细胞系，可以作为向胰岛素分泌细胞诱导分化的种子细胞。

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