沙眼衣原体持续感染对Hela细胞TLR4/IL-6/STAT3信号通路的影响＊

李 伟，林 琳，张宁洁，陈 恩，王芙艳，霍 治，余 平

(中南大学基础医学院免疫学系，湖南 长沙 410008)

沙眼衣原体是一类专性细胞内寄生的原核微生物，为临床上导致失明的主要病因之一，也是最常见的性传播性疾病(Sex transmitted disease，STD)病原体，WHO报道全世界每年有约9千万新发STD病例是因感染Ct所致［1］。虽然Ct感染可用抗生素治疗，但由于感染后症状常不明显，甚至没有自觉症状，往往会延误诊治，造成Ct持续感染［2］，引起尿道炎、盆腔炎、输卵管性不孕等多种疾病，甚至与HIV感染及肿瘤也有密切关系［3-5］。接种疫苗将是预防和控制Ct感染最有效的方式，但由于对机体的抗Ct感染免疫机制了解不够，目前尚无有效的疫苗。

Toll-Like受体(Toll-like receptors，TLRs)主要表达在具有免疫功能的组织［6］，例如:脾脏和外周血白细胞以及与外环境相通的呼吸和消化道、生殖道等，在早期固有免疫中对入侵病原微生物的识别发挥重要作用。这些进化保守的受体可识别表达在病原微生物上的高度保守的病原相关的分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，如酵母细胞壁上的甘露糖，各种细菌的脂多糖、多肽糖、胞壁酸等细胞壁成分，及鞭毛蛋白、细菌DNA和病毒的双链RNA。TLRs受PAMPs刺激而启动包括一些蛋白(例如MyD88和IRAK)的下游信号级联，导致转录因子NF-kB的激活，诱导促炎/抑炎细胞因子和直接参与适应性免疫应答的效应细胞因子的分泌。

TLRs在Ct感染中的作用已被深入研究，主要集中于上皮细胞、树突状细胞(DC)及巨噬细胞(Mφ)上的 TLRs，尤其以 TLR2、TLR4的作用最为突出［7，8］。如 Ct的 LPS 及 cHSP60 可经 TLR2 或 TLR4途径被上皮细胞、树突状细胞等识别，诱生IL-6、IFN-β等，进而对获得性免疫进行调节［9］。目前已有的关于衣原体感染后TLRs表达变化的研究证据在不同的研究报道中并不一致，其原因可能与各研究中使用的衣原体菌株及感染靶细胞株不同有关，也有可能与所建立的感染模型不同(急性/持续性)有关，但目前尚无这方面的研究报道。

已有研究证实在Ct感染后，Ct的某些组分可经TLRs信号通路刺激上皮细胞、抗原提呈细胞(APC)等产生前炎症因子，而我们认为在感染进程的不同阶段，TLRs在靶细胞上的表达可能随着感染的进程变化而变化，进而影响前炎症因子的产生，最终在免疫清除及慢性炎症中表现出不同的生物学功能。我们利用Hela细胞分别建立Ct急性感染及持续性感染模型，通过荧光定量RT-PCR、ELISA等研究策略比较Ct不同感染状态下TLR4、IL-6以及其下游STAT3表达量的变化，初步探索TLRs参与衣原体持续感染的可能机制，为Ct感染及炎症的控制提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

人宫颈癌上皮细胞株Hela及Ct L2血清型为本室保存;IFN-γ购自 SIGMA;DMEM、小牛血清购自Hyclone;DEPC、Trizol、异丙醇购自北京鼎国;MMLV逆转录试剂盒购自Fermantas;qRT-PCR试剂购自BioRad;IL-6 ELISA试剂盒购自R＆D。

1.2 细胞培养和Ct急性感染模式及持续性感染模式的建立

(1)Hela细胞用含有10%小牛血清的DMEM在37℃，5%CO2的培养箱中培养。参照文献［9］进行Ct感染、增殖和滴定，分装的Ct保存在-80℃。

(2)建立急性感染模式:计数2×105个Hela细胞接种于60 mm细胞培养皿，24 h后感染Ct L2血清型 (MOI=5，MOI multiplicity of infection，感染复数)。感染细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养，分别在感染后不同时间点收取标本。

(3)建立持续性感染模式:计数2×105个Hela细胞接种于60 mm细胞培养皿，接种24 h后感染Ct L2血清型 (MOI=5)，参照前期实验结果，在2 h后加入100 U/mL的IFN-γ。感染细胞在37℃5%CO2培养箱中培养，分别在感染后不同时间点收取标本。

1.3 荧光定量 PCR技术检测 TLR4、IL-6以及STAT3转录水平

分别在Ct急性感染及持续性感染Hela细胞6 h、18 h、24 h和48 h(分别代表Ct发育周期的极早期、早期、中期和晚期)后收集细胞样本，同时收集相同时间点未感染细胞样本作为对照，参照使用说明书用TRIzol法抽提总RNA。将RNA样本用MMLV试剂盒逆转录合成cDNA，保存在-80℃。

并利用Primer2.0及Primer-Blast设计待测基因的引物(表1)用于qRT-PCR检测mRNA表达量。所采用的qRT-PCR体系(20μL)为:

qRT-PCR循环条件如下:95℃变性2 min，后以94℃变性15 s，55℃退火15 s，40个循环，每一循环结束后记录荧光值，扩增完毕后绘制熔解曲线。采用△△Ct法计算各目的基因 mRNA的表达变化。使用BioRad CFX manager 2.0分析不同感染状态下基因的差异表达情况。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 The primers for qRT-PCR

1.4 ELISA检测IL-6分泌水平

分别在Ct急性感染及持续性感染Hela细胞6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后收集培养上清，同时收集相同时间点未感染培养上清样本作为对照，分装后保存在-80℃。用双抗夹心ELISA方法检测上清液中IL-6浓度。操作根据试剂盒说明书进行。

1.5 统计分析

所有资料处理均使用SPSS13.0软件进行分析，检测结果以表示，组间比较采用独立样本的t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 成功构建Ct持续性感染模型

在前期实验基础上，我们利用IFN-γ建立了Ct L2持续感染Hela细胞的模型(图1)。

图1 光学显微镜下观察L2急性感染(acute)及IFN-γ诱导的持续性感染(IFN-γ-prst)的Hela细胞(姬姆萨染色，40×10)Fig.1 Observed under optical microscope:acute infection(acute)and IFN-γ-induced persistent infection(IFN-γ-prst)of L2 in Hela cells(Giemsa staining，40 × 10)

2.2 不同感染组中 TLR4、IL-6和STAT3的表达变化

利用qRT-PCR方法发现，L2感染后Hela细胞的TLR4转录水平出现上调，且随着感染时间延长，上调程度增加;与急性感染相比较，IFN-γ诱导的L2持续感染状态下Hela细胞的 TLR4转录水平上调改变得更为显著(图2)。而IL-6转录水平的表达也表现出相似的改变，在持续性感染状态下Hela细胞内IL-6转录水平比未感染组、急性感染组显著增加，并呈时间依赖性增加，而且与TLR4的转录表达上调趋势相一致(图3)。STAT3的转录水平在持续性感染18 h明显增强，之后随时间推移转录水平逐渐下调，但总体转录水平比未感染组和急性感染组显著增高(图 4)。

图2 qRT-PCR技术检测L2不同感染模式下，Hela细胞不同时间点TLR4的转录水平mock:未感染;acute:急性感染模型;IFN-γ-prst:IFN-γ诱导的持续感染模型 (*P＜0.05)Fig.2 qRT-PCR detection of TLR4 transcription level in Hela cells in different pattern of L2 infection at different time points(*P ＜0.05)mock:mock infecion;acute:acute infection;IFN-γprst:IFN-γ-induced persistent infection

图3 qRT-PCR技术检测L2不同感染模式下，Hela细胞不同时间点IL-6的转录水平mock:未感染;acute:急性感染模型;IFN-γ-prst:IFN-γ诱导的持续感染模型 (*P＜0.05)Fig.3 qRT-PCR detection of IL-6 transcription level in Hela cells in different pattern of L2 infection at different time points(*P ＜0.05)mock:mock infection acute;acute infection:IFN-γprst:IFN-γ-induced persistent infection

2.3 不同感染组中IL-6分泌水平

图4 qRT-PCR技术检测L2不同感染模式下，Hela细胞不同时间点STAT3的转录水平mock:未感染;acute:急性感染模型;IFN-γ-prst:IFN-γ诱导的持续感染模型(*P＜0.05)Fig.4 qRT-PCR detection of STAT3 transcription level in Hela cells in different pattern of L2 infection at different time points(*P ＜0.05)mock:mock infection;acute:acute infection;IFN-γprst:IFN-γ-induced persistent infection

利用ELISA方法检测细胞因子分泌发现，L2感染后Hela细胞的IL-6分泌水平出现明显上调，且随着感染时间延长，上调程度增加;与急性感染相比较，IFN-γ诱导的L2持续感染状态下Hela细胞的IL-6分泌水平上调改变得更为显著(图4)。

图5 ELISA检测L2不同感染模式下，培养Hela细胞不同时间后上清中IL-6的浓度mock:未感染;acute:急性感染模型;IFN-γ-prst:IFN-γ诱导的持续感染模型(*P＜0.05)Fig.5 ELISA detection of IL-6 secretion level in Hela cells supernatant in different pattern of L2 infection at different time points(*P ＜0.05)mock:mock infection;acute:acute infection;IFN-γprst:IFN-γ-induced persistent infection

3 讨论

Ct在宿主细胞内的繁殖呈特殊的二相发育周期，分别为有感染性、无分裂能力的原体(Elementary body，EB)及快速生长但无感染性的网状体(Reticulate body，RB)。RB以二分裂方式增殖后再度分化成EB，EB从细胞释放后再次感染新的宿主细胞，整个发育周期约需 48-72 h［2］。在饥饿、抗生素、IFN-γ作用以及抗感染免疫等条件下，Ct在宿主细胞内会形成非典型感染状态，电镜下表现为既不同于原体也不同于始体的细胞，被称为异常RB，为目前公认的Ct持续感染显微结构［10］。在前期实验基础上，我们利用IFN-γ建立了Ct L2持续感染Hela细胞的模型。光镜下观察发现持续感染状态下的L2包涵体体积小于急性感染状态下的L2包涵体，但更细微的亚细胞结构则需要在电镜下观察。

TLRs是广泛存在于固有免疫细胞上的一类模式识别受体(Pattern-recognition receptors，PRRs)，可识别多种PAMPs［6］。在病原体入侵的几分钟内，各种TLRs即可通过相同或不同的胞内信号转导途径诱导一系列基因活化，致使细胞分泌炎症细胞因子和趋化因子，诱发炎症反应，产生固有免疫应答，并在适应性免疫应答中起重要的调节作用。已有研究证实，急性感染状态下，TLR4信号途径可识别Ct来源的 cHSP60、LPS 等 PAMPs，诱生 IFN-γ、IL-6、IL-10 等多种炎症因子，在调控固有免疫细胞的活性、控制或消除感染中起重要作用［7，8］。我们研究发现，随着Ct感染时间延长，Hela细胞的TLR4转录水平明显升高，与Ct急性感染相比较，持续感染模型中的变化更为显著，提示Ct持续感染状态下宿主细胞内的TLR4信号通路受到了调控，但其具体调控机制及作用尚不明确。

现已知TLRs途径可诱导细胞因子产生。TLR4单抗可有效阻断肺炎衣原体HSP10作用的人单核-巨噬样细胞 THP-1细胞分泌 IL-6［11］。还有研究证实，TLRs信号与 IL-6间存在负反馈环［12］。我们研究发现，Ct不同感染模式下，Hela细胞的TLR4转录水平随时间变化趋势与IL-6的分泌水平一致，但两者之间是单纯的因果关系还是存在更为复杂的负反馈调控机制，还需要进一步的实验分析。

Ct感染的病理特点是炎症反应，随着反复持续感染，炎症加重，最终导致组织损伤和瘢痕形成。Ct感染的主要靶细胞是泌尿生殖道上皮细胞和眼睑粘膜上皮细胞，它们可以产生大量炎症因子，尤其是IL-1、IL-8 和 IL-6 等［7-9］，炎症因子一方面可以直接介导宿主的固有免疫应答，参与宿主抵抗Ct感染的第一道防线;另一方面可以导致组织细胞的病理损伤。因此，在感染过程中Ct与这些炎症因子的相互作用关系是疾病进展的一个重要环节，研究这些炎症因子产生的机制有助于理解Ct的致病机制，对疾病防治也有重要意义。IL-6作为具有最广泛的生物学效应的细胞因子之一，同时具有促炎和抗炎的双向作用。在内皮细胞中，IFN-γ介导的SOCS3表达导致了IL-6诱导的STAT3活化受抑，进而降低了IL-6依赖的抗炎基因表达，使得IL-6的生物学作用由抗炎向促炎发生转变，参与了内皮细胞炎症损伤［13，14］。而关于IL-6在Ct感染中的促炎和抗炎作用目前并无统一观点，之前的研究发现在衣原体的持续感染状态下有持续的IL-6的分泌［15］，我们的研究也证实在Ct感染后，尤其是持续感染状态下，宿主细胞持续高表达IL-6，且随着感染时间延长IL-6分泌量增加，提示IL-6的产生可能促进了细菌生长。但是Ct诱导IL-6的产生机制以及IL-6在Ct感染中的具体作用还不清楚，在Ct反复持续感染宿主过程中，IL-6是发挥促炎作用加重炎症还是发挥抑炎作用参与免疫调节，以及是否有助于Ct逃避免疫清除，目前仍不清楚。

STAT3是信号传导和转录活化因子(Signal transducer and activator of transcription，STAT)家族的成员之一，IL-6的信号转导主要依赖于STAT3的参与［16］。IL-6与其膜受体结合后，激活STAT3，使其二聚化进入核内启动多种基因转录活化，启动多种效应，包括细胞增殖反应、急性炎症反应以及细胞凋亡等［17］。本研究发现在用 IFN-γ建立的 Ct持续感染的模型中，与Ct急性感染相比，Hela细胞的STAT3转录水平显著升高，且呈现出在感染早期(18 h之内)急剧升高，18 h后逐渐下调的变化趋势;有趣的是，这一变化趋势与IL-6的mRNA及蛋白质表达变化并不完全一致，推测可能是某些目前尚不明确的机制(如STAT1的拮抗作用)调控了STAT3的转录及转录后的蛋白活性。但是有关Ct持续性感染后的STAT3下游信号尚不清楚，STAT3信号参与促炎还是抑炎，介导细胞损伤还是组织保护，因此我们的工作初步探索了TLRs可能参与衣原体持续感染后IL-6/STAT3信号通路的调控，更具体的分子机制还需要我们进一步的研究。

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