拟南芥prr5突变体对ABA的响应＊

向 芬，黄 帅，赵小英，刘选明，朱咏华*

(1.湖南大学生物学院，植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室，湖南长沙 410082;2.湖南省茶叶研究所，湖南长沙 410125)

植物激素脱落酸 (Abscisic acid，ABA)调控植物生长和发育的许多方面，例如:促进种子成熟、休眠，抑制种子胚的萌发、植株根的伸长和叶片气孔的关闭等等［1，2］。此外，脱落酸还是一种重要的抗逆诱导因子，介导植物对逆境如干旱、盐碱、低温等生理反应，因此对脱落酸信号转导进行研究对植物生长的调控具有重要的意义。近年来，与脱落酸信号转导有关的中间体虽然陆续被揭晓，但对脱落酸的信号转导机制了解还较少。

在高等植物中，生物钟通过振荡器的作用来调节下游功能基因的表达，达到调控许多错综复杂的新陈代谢和压力响应网络的目的［3］。PRRs(pseudoresponse regulators)家族中的 PRR7、PRR9基因是生物钟振荡器的核心成员［4，5］。有研究发现，植物信号网络包括ABA信号转导途径受内源生物钟节律调节，受ABA信号转导途径调控的冷胁迫、气孔运动同时也受生物钟的调控［6］。有研究表明，在野生型植株中ABA含量黎明时较低，在中午12点增加了2倍，但是在prr9/7/5三缺失突变体中ABA含量一直很高，说明PRR9/7/5抑制了生物合成ABA途径［3］。因此，生物钟振荡器的核心成员PRR7、PRR9与同是PRRs家族的PRR5可能为ABA信号转导途径的相关基因。

为了探讨PRR5基因是否为ABA信号转导途径的相关基因。本研究比较分析了外源ABA对prr5突变体种子萌发、根长生长的影响，以及外源ABA对PRR5基因表达的调节，并验证了NaCl对prr5突变体种子萌发的影响，进一步阐明PRR5基因在拟南芥中的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥［Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.］哥伦比亚生态型野生型(WT)Col-0为湖南大学生物学院植物分子生物学实验室保存。Col-0背景的prr5缺失突变体纯合子由美国加州大学洛杉矶分校林辰涛实验室赠送。拟南芥种子用70%乙醇灭菌30 s，10%次氯酸钠灭菌10 min，无菌水冲洗4～5次，于黑暗下4℃春化4 d后，再用0.1%的琼脂悬液悬浮种子后点播在含0.8%琼脂的MS固体培养基上，置于22℃全日照光照培养箱中培养［7］。

1.2 方法

1.2.1 ABA处理 种子萌发试验，把春化后的野生型和 prr5突变体种子点播于不同浓度(0、0.3、0.6、0.9、1.2μmol·L-1)ABA、不同浓度(0、50、100、150 mmol·L-1)NaCl的MS固体培养基上，连续7 d观察统计各种子的萌发及萌发后生长情况［8，9］。根长试验，把在MS固体培养基上生长6 d的幼苗转移到含不同 ABA 浓度(0、0.1、1、10、50μmol·L-1)的MS固体培养基上生长6 d后再测量根长。数据作图采用Microsoft Excel 2003，数据分析采用 DPS v7.55系统进行统计分析。表达分析处理试验，取生长7 d的拟南芥Col-0幼苗，根部分别置于含不同浓度(0、1、10、50、100μmol·L-1)ABA 的 MS 液体培养基中处理4 h，上述处理后的幼苗以液氮速冻，保存于-80℃冰箱中用于目标基因的表达分析［8］。

1.2.2 RNA 提取 按Easy Way RNA Mini Kit试剂盒(安比奥生物技术有限公司)说明书提取不同浓度ABA处理过的Col-0幼苗总RNA，按照Invitrogen M-MLV Reverse Transcriptase Instruction说明书进行逆转录，合成 cDNA［10］。该合成链作为 RT-PCR的模板，用于检测PRR5基因的表达水平。引物序列见表1。

1.2.3 实时荧光定量 PCR(real time quantitative PCR)反应体系 RT-PCR以上述合成的cDNA为模板，反应体系为 20μL，包括双蒸水 10.8μL，10 × 缓冲 液 2μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.4μL，MgCl21.6μL，引物各 0.1μL，SYBR Green I 0.5μL，ROX 0.1μL，2.5 U·μL-1Jump Start Taq 聚合酶(Sigma)0.4μL，cDNA 模板 4μL。其中，ROX 为被动参考染料。反应程序为95℃ 10 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。试验数据采用 MxPro软件(Stratagene)进行分析［11］。ACT2的表达水平被用作均一化的内参，未经ABA处理过的样本作为参比样本，检测样品均为3次重复。

表1 实时定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used in real time quantitative PCR analysis

2 结果和分析

2.1 ABA处理对prr5突变体种子萌发的影响

ABA抑制种子的萌发，为了初步确定prr5突变体是否与ABA信号调控关联，将野生型与prr5突变体播种在含不同浓度(0、0.3、0.6、0.9、1.2μmol·L-1)ABA的MS培养基中，培养7 d后对种子萌发率及子叶变绿率进行统计分析，图1显示，经不同浓度ABA处理7 d后，prr5种子萌发率较野生型高，除0.3μmol·L-1浓度呈显著差异，其他浓度都呈极显著差异，即表示prr5对ABA弱敏感。prr5突变体子叶变绿率在 ABA浓度为0.3μmol·L-1以下比野生型高。同时，将prr5突变体种子点播于含不同浓度(0.3、0.9μmol·L-1)ABA 的 MS 固体培养基上，连续5 d观察统计种子的萌发情况。从图2可以看出，prr5 种子的萌发率在 ABA 浓度为0.3、0.9μmol·L-1时一直较野生型高，其中，在 ABA浓度为0.3μmol·L-1的MS培养基上突变体萌发率呈显著或极显著增加，在 ABA 浓度为 0.9μmol·L-1上第 2、3 d 其萌发率都存在极显著差异。

图1 外源ABA对prr5突变体种子萌发率(A)及萌发后生长(子叶变绿率B)的影响Fig.1 Effects of exogenous ABA on germination inhibition(A)and post-germination growth(green cotyledons B)of prr5 mutant and wild-type seeds

图2 prr5突变体和野生型在ABA浓度为0.3(A)、0.9(B)μmol·L-1的 MS培养基上生长1、2、3、4、5 d 的萌发率Fig.2 Germination efficiency of wild type and prr5 mutant seeds on day 1 to day 5 with 0.3(A)and 0.9(B)μmol·L-1ABA treatment

2.2 ABA对prr5突变体幼苗主根伸长的影响

ABA对主根伸长有抑制作用，为了进一步从表型上探讨PRR5基因是否与ABA信号转导途径关联，将在MS固体培养基上生长6 d的幼苗转移到含不同浓度(0、0.1、1、10、50μmol·L-1)ABA 的 MS 固体培养基上，6 d后测量主根长度，从图3可以看出，经不同浓度ABA处理后，prr5突变体的主根长度都较野生型长，其中犹以1、50μmol·L-1ABA 浓度处理后突变体主根呈显著、极显著增长，即prr5也表现出对ABA弱敏感。

2.3 ABA对PRR5基因相对表达的影响

为了进一步验证PRR5基因是否与ABA信号途径关联，进一步从表达水平上检测prr5是否受ABA调控。将拟南芥野生型7 d龄幼苗用不同浓度(0、1、10、50、100μmol·L-1)ABA 分别处理后，用实时定量PCR的方法对处理后幼苗中prr5的表达进行了分析，从图4可以看出，低浓度ABA对PRR5基因表达的抑制作用明显，随浓度增加，抑制作用下降，但表达量均比未经过ABA处理的要低，到100μmol·L-1浓度时跟未经过处理的对照表达量基本一致，即PRR5基因表现出在高浓度时对ABA弱敏感。

图3 外源ABA对prr5突变体和野生型幼苗主根伸长的影响。野生型与prr5突变体幼苗在不含ABA的MS固体培养基上生长6天后转移到含不同浓度(0，0.1，1，10，50μmol·L-1)ABA 的 MS 固体培养基上生长6天的根长生长情况Fig.3 Effects of exogenous ABA on the roots growth of prr5 mutant and wild-type seedlings.Sensitivity of root growth to ABA of the wild type and prr5 mutant，which are grown for 6 days on ABA-free medium and then incubated vertically for 6 days on medium with 0，0.1，1，10 or 50μmol·L-1ABA，respectively

图4 不同浓度ABA处理拟南芥幼苗后PRR5基因的表达Fig.4 The expression profiles of prr5 gene in seedling in response to different concentrations of ABA

2.4 NaCl处理对prr5突变体种子萌发的影响

脱落酸是一种重要的抗逆诱导因子，介导植物对逆境如干旱、盐碱、低温等生理反应。为了研究prr5突变体对盐胁迫是否产生反应，将突变体及野生型种子培养在含不同浓度(0、50、100、150 mmol·L-1)NaCl的MS固体培养基上，培养生长7 d后统计分析种子萌发率及子叶变绿率。图5显示，在不含NaCl的MS固体培养基上生长7 d后的种子萌发率、子叶变绿率与野生型相一致，但prr5突变体在含50、100、150 mmol·L-1NaCl MS固体培养基上的萌发率、子叶变绿率都比野生型的高，且均达到极显著水平，犹以在含150 mmol·L-1NaCl培养基上生长变化最明显。

图5 外源NaCl对prr5突变体和野生型萌发率(A)及萌发后生长(子叶变绿率B)的影响Fig.5 Effects of exogenous NaCl on germination(A)and post-germination growth(green cotyledons B)of prr5 mutant and wild-type seeds

3 讨论

脱落酸是一种重要的植物激素，具有广泛的生理功能，其信号转导途径是一个复杂的信号转导网络［12］。该信号网络能被生物钟节律调节。有研究发现生物钟核心振荡器成员PRR5、PRR7、PRR9的三缺失突变体prr9/7/5对ABA生物合成具有抑制作用。本研究用ABA处理prr5突变体及野生型，发现prr5突变体种子萌发率比野生型显著或极显著增高，主根比野生型长，即对ABA弱敏感。对野生型进行不同浓度ABA处理，发现PRR5基因表达受抑制，因此推测该基因可能为ABA信号转导途径的相关基因。同时，对prr5突变体与野生型种子进行NaCl处理，prr5突变体种子的萌发率比野生型极显著增高，说明PRR5基因可能参与盐胁迫调节，由于ABA作为一种重要的抗逆诱导因子，介导植物对逆境如干旱、盐碱、低温等生理反应，NaCl处理实验从侧面验证了PRR5基因对ABA的响应。

TOC1 也属于 PRRs基因家族［13，14］。有研究指出，TOC1是一个联系生物钟和干旱胁迫的分子开关，TOC1-ox受干旱存活率比野生型低，TOC1 RNAi存活率比野生型的高［15］。Castells等［16］研究认为TOC1调控ABA相关基因ABAR/CHLH/GUN5的表达是通过结合它的启动子来进行的，同时发现toc1-2突变体经ABA处理后的萌发率比野生型高，TOC1-ox突变体的萌发率比野生型低。因此，PRRs基因家族的其它成员有可能为ABA信号转导途径的相关基因。本试验证明了PRR5参与了ABA信号转导。prr5缺失突变体受ABA处理后的萌发率比野生型高，prr5缺失突变体的根长伸长也比野生型长，都表现出对ABA弱敏感，与上述toc1-2突变体对ABA处理后的结果相一致。因此，我们推测PRR5基因也可能通过调控ABA信号相关基因参与ABA信号途径，我们将在今后作更深入的研究。

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