伊布利特对兔左心室中层细胞瞬间外向钾电流活性的影响

宋春丽 董巍 赵刚 刘红彬 王丽娅 吉丽

伊布利特是一种新型的Ⅲ类抗心律药物，其对房颤、房扑的转复治疗有明显效果，但对室性心律失常的研究笔者所见报道不多。本文采取酶解法分离兔单个M细胞，应用膜片钳技术，通过离子通道角度观察不同浓度的伊布利特对M细胞瞬间外向钾电流(transient outside potassium current，Ito)活性的影响，为伊布利特用于临床室性心律失常治疗提供一定的基础研究。

1 材料与方法

1．1 实验动物 健康新西兰纯种白兔60只，雌雄兼用，重量2．3～2．5 kg。由河北医科大学实验动物中心提供。饲养温度18～29℃，相对湿度40% ～70%，颗粒饲料喂养。

1．2 液体配制 (1)Tyrode液、酶液、细胞保存液、Ito电极内液、Ito细胞外液的配置参照文献［1］;(2)伊布利特液:伊布利特10 mg，三水醋酸钠18．9 mg，氯化钠890 mg，用盐酸调整pH值约4．6和注射用水适量加至100 ml，溶液配制完毕后充以100%的氧气5 min以上;(3)富马酸伊布利特由石药集团中诺药业(石家庄)有限公司提供。实验时在含有Ito的灌流液中加入伊布利特，使其最终的浓度达10－5mol/L、10－6mol/L。

1．3 单细胞分离［2］报道的方法分离出单个的心室肌细胞。整个过程保持恒温36℃同时充入氧气。

1．4 膜片钳全细胞记录［2］选择条理清晰、表面光滑的单个心室肌细胞在25℃室温下分别用正常的Ito外液和加入伊布利特 10－5mol/L、10－6mol/L 的 Ito 外 液 灌 流，灌 流 时 间5～10 min，速度为2 ml/min，使之达到规定的浓度，细胞破膜后稳定5 min后分别记录3组细胞液灌流后电流。

1．5 Ito记录方法 先将细胞钳制在－40 mV，50 ms后依次阶跃10 mV去极化至 +110 mV，时程250 ms，刺激频率0．5 Hz。以电压为横坐标，电流密度为纵坐标得到电流-电压曲线(I-V曲线)，比较3组I-V曲线及+60 mV的Ito峰值电流密度变化。采用双脉冲刺激法，先将细胞钳制在 －50 mV，超极化至－160 mV，持续250 ms，阶跃10 mV，去极化至 +70 mV，以电压值为横坐标，以Ito电流浓度为纵坐标，得到Ito的失活曲线。观察3组的Ito电压依赖性稳态失活曲线及V0．5(半数失活电压)的变化。当HP=－40 mV，去极化到+60 mV，测试脉冲与条件脉冲的间隔开始为30 ms，增量为15 ms逐级递增至165 ms。以测试脉冲与条件脉冲的Ito之比为横坐标，与恢复时间间隔为横坐标作图，得失活后再恢复曲线。观察3组的Ito失活后再恢复过程的变化。

1．6统计学分析应用SPSS 11．0统计软件，计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 伊布利特对I-V曲线的影响 3组呈电压及浓度依赖性线形激活过程，10－5mol/L组，10-6 mol/L组I-V曲线均下移，对照组细胞在 －30 mV激活，伊布利特10-6 mol/L组在+10 mV激活，伊布利特10－5mol/L组在+20 mV激活。测试电压+60 mV时电流密度显示:对照组(n=14 cells)为(17．4±5．2)pA/pF，10－6mol/L 组(n=14 cells)为(6．0 ±1．2)pA/pF，与对照组相比下降明显(P ＜0．01)。10－5mol/L组(n=14 cells)为(4．5±1．1)pA/pF，与对照组比较有明显下降(P ＜0．01)。10－5mol/L组与10－6mol/L组比较差异有统计学意义(P＜0．01)。用药前及低、高剂量伊布利特灌流后Ito形态曲线见图1。3种状态下Ito的I-V曲线见图2。

2．2 伊布利特对稳态失活曲线的影响 10－5mol/L组、10－6mol/L组失活曲线显著左移，以10－5mol/L组明显。3组的半数最大失活电压，对照组(n=12 cells)为－(72．0±3．4)mV，10－6mol/L组(n=14 cells)为 － (109．4 ±4．6)mV，与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0．01)，10－5mol/L组(n=14 cells)为 －(127．1 ±2．8)mV，与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0．01)，10－5mol/L 组和 10－6mol/L 组比较，差异有统计学意义(P ＜0．01)。见图3。

图1 3组细胞的钾电流原始图

图2 3组细胞的钾电流I-V曲线图

图3 3组细胞的钾电流稳态失活曲线图

2．3 伊布利特对失活后再恢复曲线的影响 当2个脉冲间隔时间为45 ms时，对照组(n=12 cells)恢复42%，10－6mol/L组(n=15 cells)恢复31%，10－5mol/L组(n=15 cells)恢复25%，10－6mol/L，10－5mol/L组失活后再恢复与对照组相比，明显减慢(P＜0．01)。当2个脉冲间隔时间为90 ms时，对照组(n=12 cells)恢复82%，10－6mol/L组(n=15 cells)恢复66%，10－5mol/L 组(n=15 cells)恢复 55%，10－6mol/L 和10－5mol/L组失活后再恢复与对照组比较差异有统计学意义(P ＜0．01)。见图 4。比较 3 组细胞在 45、90、120、165 ms失活后再恢复的程度，说明再恢复减慢。见图5。3组Ito失活后再恢复的原始电流图，显示伊布利特10－5mol/L和10－6mol/L组使Ito电流减小，再恢复减慢，其中10－5mol/L减慢最为明显。见图6。

图4 3组细胞的钾电流失活后再恢复曲线图

图5 3组细胞的失活后再恢复的程度比较

图6 3组细胞的钾电流失活后再恢复原始记录图

3 讨论

伊布利特应用于临床房颤、房扑的药物转复已作为Ⅰ类A级适应证写入2006年ACC/AHA/ESC心房颤动治疗指南。伊布利特对房性心律失常的治疗有较好的疗效。该药对室性心律失常也有抑制作用。伊布利特延长心室肌的有效不应期和QT间期，其增加心室跨壁复极离散度的作用呈剂量依赖性。伊布利特减慢心室率，有抑制室速、室颤的作用，并能降低室颤除颤的阈值［3］。但其抗室性心律失常的确切电生理机制尚不清楚。

有研究认为，国产伊布利特的临床应用将能影响我国心律失常药物治疗的现状［4］。其主要电生理机制为抑制复极时K+外向电流(Ikr)，促进平台期缓慢内向Na+电流，抑制0相快钠内流，促进平台期内向Ca2+内流，此电生理机制已得到专家共识［3］，但其对Ito的研究笔者尚未见相关报道。Ito电流在动作电位的早期出现，与动作电位的1相有关，并参与动作电位的2相平台期早期，它的改变可对动作电位时限产生较大影响。Ito分2型:Ito1和Ito2，Ito1对4-氨基吡啶(4-aminopyridine)敏感，又称4-aminopyridine敏感型的瞬时外向钾电流;实验细胞外液中加入CdCl2以阻断细胞外钙离子内流和电极内液中含EGTA螯合细胞内钙离子，从而达到阻断Ito2而记录Ito1。通常所指的Ito为Ito1，与心律失常的产生关系密切。本研究发现:伊布利特用药组Ito电流峰值不同程度的下降，激活电压及峰值右移，I-V曲线均下移，失活曲线、半数失活电压明显左移，失活后再恢复减慢，这些变化引起心肌细胞1相复极延迟，并导致动作电位2相平台期相对延长，从而延长心室肌有效不应期、动作电位时程和QT间期，使传导减慢，故对室性心律失常起抑制作用。伊布利特引起心肌细胞Ito的抑制呈浓度依赖性，高浓度组的伊布利特对Ito抑制作用明显强于低浓度组。

Ito在左心室游离壁的分布呈现出跨壁梯度，从心内膜到心外膜Ito密度逐渐增加，这被认为是心室壁心肌细胞电生理性质空间变异性产生的重要原因。有学者认为Ito的这种分布梯度也可能是决定整个心脏复极和除极顺序的电学基础，是导致2相全或无复极、动作电位平台期不一致改变和2相折返的最重要的离子流之一，2相折返的机制与Ito跨心肌壁复极不均一性有关，促进室速或室颤的发生［5］。伊布利特作用心室肌M细胞后显示:伊布利特抑制Ito，从而使1相复极延迟，并导致动作电位2相平台期相对延长。使复极趋向一致，消除心室复极离散度，有利于消除折返，抑制室性快速心律失常的发生。

M细胞最显著的特征是其具有比心内、外膜层肌细胞明显长的动作电位时程(APD)，具有明显的慢频率依赖性和较优势的Ito［6］。是否延长QT间期是III类抗心律失常药物发挥作用的表现。在缓慢心率或刺激条件下，伊布利特对M细胞Ito的抑制作用，使其QT间期过度延长并在此基础上易产生后除极(EAD)，局部EAD引起触发活动，易导致尖端扭转性室速。尤其见于女性、高龄、低钾血症、低镁血症、心力衰竭与心肌肥厚患者［7－9］。发生尖端扭转室速时应立即行直流电复律。

综上所述，伊布利特对心室肌细胞Ito的抑制作用可部分解释其抗室性心律失常的离子机制。由于本研究样本数较少，存在一定的局限性，有待进一步增加样本例数深入研究。且仅对动物正常的心室肌细胞进行了实验室观察，对临床应用是否抑制室性心律失常的发生或转复须进一步观察。

1 丁超，傅向华，何振山，等．辛伐他汀对血脂正常兔心肌缺血再灌注后瞬间外向钾通道电流的影响．中国病理生理，2009，25:299-303．

2 齐书英，张霞，刘晓云，等．缺血/再灌注对心肌瞬间外向钾电流的影响．心脏杂志，2006，18:47-49．

3 中国生物医学工程学会心律分会，中国医药生物技术协会心电学技术分会．中国医师协会心血管内科医师分会，伊布利特临床应用中国专家共识(2010)．中国心脏起搏与心电生理杂志，2011，25:1-11．

4 王建安．国产伊布利特将影响我国心律失常药物的治疗现状．临床心电学杂志，2008，17:1-3．

5 Antzelevitch C，Brugada P，Brugada J，et al．Brugada syndrome:a decade of progress．Circ Res，2002，91:1114-1118．

6 姚浩洁，齐书英，何振山，等．伊布利特对家兔左心室肌细胞快钠通道跨壁异质性的影响．中国老年学杂志，2008，28:2209-2211．

7 Jonsson MK，Vos MA，Duker G，et al．Gender disparity in cardiac electrophysiology:implications for cardiac safety pharmacology．Pharmaeol Ther，2010，127:9-18．

8 Taira CA，Opezzo JA，Mayer MA，et al．Cardiovascular drugs inducing QT prolongation:facts and evidence．Curr Drug Saf，2010，5:65-72．

9 Farkas AS，Nattel S．Minimizing-repolarization related proarrhythmic risk in drug development and clinical practice．Drugs，2010，70:573-603．