高血压病患者基质金属蛋白酶3基因多态性与左室重构的关系*

邵也常， 邓木兰， 符永恒， 许 燕， 石美玲

左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是左心室对各种机械和激素刺激产生的适应性反应，其中以高血压诱导的LVH为主，是心血管疾病发病和死亡增加的主要独立危险因子，也是左心室重构发生的基础，最终将导致充血性心力衰竭［1］。高血压诱导LVH的具体机制目前尚未被完全阐明，细胞外基质定性和定量的改变对心肌细胞排列、心肌几何学构型的影响可能是关键因素。而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一组能特异降解细胞外基质成分的Zn2+依赖的酶，在组织重构中起重要作用，作为MMPs家族激活共同途径的MMP-3通过胶原降解及激活其它MMPs直接参与了心肌的重构，目前发现MMP-3存在基因多态性，其不同基因型对心血管疾病的发生、发展有着不同的影响，其对左室重构的作用如何，未见相关报道。本研究就高血压病患者MMP-3基因多态性对血清MMP-3的表达与左室重构的关系进行了分析和探讨。

材料和方法

1 临床资料

入选标准:按照《中国高血压防治指南》标准确诊的高血压病患者，签署知情同意书。排除标准:恶性肿瘤、骨关节疾病、肝肾功能障碍、怀孕、严重精神疾病患者。共入选190名高血压病患者，男性107人，女性83人，平均年龄(57.25±7.03)岁。所有患者均自愿入组，对研究内容知情同意，本研究内容经广东省人民医院医学伦理委员会的批准，符合伦理学要求。

2 主要方法

2.1 血清MMP-3检测 血液标本采集:早晨空腹抽静脉血各2试管，一管EDTA-Na2抗凝，用于DNA抽提;另一管不加抗凝剂，高速离心机3 000 r/min离心10 min，分离血清，用于MMP-3含量检测。血清MMP-3水平应用ELISA试剂盒，美国BIO-REK多通道酶标仪(型号:SYNERGY TM HT)进行检测。2.2 MMP-3基因多态性检测

2.2.1 DNA提取 应用天根公司的血液基因组提取试剂盒，参照说明书操作步骤进行。

2.2.2 PCR扩增 用Primer Premier 5软件进行引物设计，目标基因是MMP-3基因启动子序列。上游引物 5’-CCACCACTCTGTTCTC-3’，下游引物 5’-CCCTATGACTGAAGATGC-3’，由英韦创津公司合成引物。PCR 反应体系(25 μL):10 × 缓冲液 2.5 μL，4 × dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL ，上、下游引物各 1 μL，rTaq DNA 酶0.15 μL，DNA 模板2 μL，然后加双蒸水至总体积25 μL。PCR反应条件:95℃预变性4 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增 30 个循环，最后72℃ 5 min。取PCR产物3 μL进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，120 V电泳30 min。然后用0.005%溴化乙啶染色。紫外灯下观察结果。PCR产物送华大基因公司进行测序。

2.3 心脏多普勒超声检测 患者取左侧卧位，于胸骨左缘长轴面按美国超声心动协会标准，测定舒张末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LPWT)、室间隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)、左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd)和左心室收缩末期内径(left ventricular end-sysytolic diameter，LVEDs)，连续测定3个心动周期取平均值。有关计算公式:体重指数(body mass index，BMI)=weight/height2;体表面积(body surface area，BSA)=0.0061 ×height(cm)+0.0128×weight(kg)－0.1529;左室重量(left ventricular mass，LVM)=0.8 ×［1.04 × (IVST+LVEDd+LPWT)3-LVEDd3］+0.6;左室重量指数(left ventricular mass index，LVMI，g/m2)=LVM/BSA(其中IVST、LVEDd和LPWT单位是cm)。左室肥厚诊断标准:LPWT≥12 mm 和(或)LVMI男≥130 g/m2，女≥120 g/m2。

3 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件处理数据，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，正态分布且方差齐的计量资料采用两独立样本t检验，不符合正态分布或方差不齐者采用Wilcoxon秩和检验，Spearman相关分析;多组资料比较采用方差分析。基因型及等位基因频率采用以下公式计算:等位基因频率=1/2(纯合子×2+杂合子)/被检人数。组间基因型及等位基因频率比较采用卡方检验。

结 果

1 基本情况

本组高血压患者伴有左室肥厚者108人，无左室肥厚者82人。MMP-3基因型测序结果6A纯合子128例，5A纯合子9例，5A/6A杂合子53例。

2 心脏B超结果

5A基因型左室重量和左室重量指数都要大于6A基因型，差异显著，室间隔厚度和左室后壁厚度5A基因型也比6A基因型稍大，但差异未达到统计学意义，见表1。携带5A基因的高血压患者比携带6A基因的高血压患者似乎更容易发生左室肥厚，差异显著，OR=2.05，见表 2。

3 基因型与血清MMP-3水平

5A基因型MMP-3水平要比6A基因型高，分别为5A 基因型(145.35 ±83.29)μg/L、5A/6A 基因型(132.26 ±81.29)μg/L 和 6A 基因型(108.23 ±45.61)μg/L，但各组之间差异无显著。

4 MMP-3血清水平与心脏B超

MMP-3血清水平与心脏B超测量指标进行相关分析显示，MMP-3血清水平与室间隔厚度、左室后壁厚度、左室重量和左室重量指数均呈正相关(P＜0.01)。

讨 论

Figure 1.The results of MMP-3 DNA sequencing.Arrows indicate the location of 5A/6A polymorphism in the promoter of MMP-3 gene.A:6A/6A genotype;B:5A/6A genotype;C:5A/5A genotype.图1 MMP-3基因启动子测序结果

表1 不同基因型高血压患者心脏B超测量指标Table 1.The echocardiography indicators of the heart in hypertensive patients with different genotypes(Mean±SD)

左心室重构是心脏对高血压介导的压力超负荷的早期代偿性反应，主要表现为心肌细胞肥大和细胞外基质异常。环境刺激和组织损伤后，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在数量、组成及空间结构上发生改变，以维持组织的正常结构和功能，因此ECM在维持心脏结构和功能的完整性中发挥着重要作用［2］。ECM主要由3种成分组成:(1)纤维状蛋白，主要为Ⅰ、III型胶原和弹力蛋白;(2)蛋白聚糖;(3)基底膜蛋白，主要为Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和纤维连接蛋白。ECM中来自于成纤维细胞的Ⅰ、III型胶原与心脏结构和功能密切相关。心肌ECM中Ⅰ型胶原、III型胶原占优势。前者具有高度牵引力和硬度，而后者具有弹性。在高血压心脏病患者的心肌组织中Ⅰ型胶原明显增加，Ⅰ型胶原/III型胶原明显上升，组织僵硬且顺应性减低［3］。ECM形成的细胞间网络为心肌细胞提供机械支持，保持其排列次序，对于心肌组织的完整性和连贯性至关重要，特别是当其肥大和增生的时候。动物和人体模型的研究都报道心肌层胶原结构和组分的变更能够对左心室形态和功能产生渐进性影响。心肌胶原基质可维持心肌细胞及心肌纤维的排列、限制心肌细胞过度拉长。心肌基质的改变还可造成心肌收缩和有效射血之间失去协调性，并且对维持左室的几何形状有明显的支持作用，减轻泵功能受损。左室泵功能下降早期伴随左室扩大、室壁变薄及心肌细胞拉长，其中一个重要的因素就是心肌胶原纤维的丧失。而胶原的降解主要受锌、钙离子依赖的蛋白水解酶——MMPs的调控。

表2 各基因型高血压患者左室肥厚情况Table 2.Left ventricular hypertrophy in hypertensive patients with different genotypes and alleles

MMPs是一组能特异降解细胞外基质成分的Zn2+依赖的酶，在组织重构中起重要作用。至今发现人体内有5大类24种MMPs。MMPs主要分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素及膜型 MMPs(MTMMPs)。各种MMPs以酶原的形式分泌到细胞外后，在其它酶的作用下前肽裂解而激活［4］，已经证明MMPs活性在基因转录、酶原合成、酶活化水平上受多种因素调节。在心血管系统的重构过程中MMPs通过影响ECM的降解在高血压病及其并发症的发生、发展中起重要作用。MMP-3又称为基质溶解素1(stromelysin 1)，分子量为57 kD，在 MMPs家族中具有独特的功能，它不仅可以降解纤维连接蛋白、层黏连蛋白、蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅹ型胶原等多种底物，还有激活其它种类MMPs的作用，它是MMPs家族激活的共同途径，MMP-3通过胶原降解及激活其它MMPs直接参与了心肌的重构。Saglam等［5］研究发现血浆MMP-3和MMP-9在高血压左室肥厚的患者明显升高，并与左室后壁厚度呈正比，因此提出在降低血压的同时降低MMPs浓度对于左室舒张功能有改善作用。在绵羊左室肥厚模型中观察到代偿性左室肥厚伴随包括MMP-3在内的多种MMPs升高［6］。对扩张性心肌病的研究发现，左心室心肌细胞MMP-3活性比正常对照高4倍。MMPs表达和活性升高，参与了早期左室心肌的重构，应用MMPs抑制剂，可减少左室扩张程度并改善泵功能，因此作者提出调整心肌MMPs的表达和活性，可作为控制心肌基质重构的重要治疗目标［7］。Hayashidani等［8］研究发现心力衰竭大鼠心室肌中MMPs活性增高，TIMPs-3的含量减少，同时心室肌胶原纤维束变细、断裂，胶原含量减少，表明MMPs活性增高，TIMPs-3的减少增加了基质的重构，使心功能从代偿期转变为失代偿期。心功能越差，MMP-3在心肌组织的表达越高，其与左室射血分数、心指数呈负相关。单纯的II型糖尿病人血浆MMP-3水平与正常人没有差别，而当糖尿病合并有大血管病变时，其MMP-3水平显著升高，说明MMP-3参与了糖尿病大血管病变的发生［9］。我们的研究观察到MMP-3血清水平与左室肥厚指标正相关，可能是MMP-3过度表达引起ECM降解增加，胶原网结构的破坏，使心肌细胞之间的连接趋于松散，心肌细胞排列紊乱，室壁厚度增加。体外细胞培养显示，正常情况下，α-I型、α-II型胶原纤维表达与MMP-3的表达一致，当α-I型、α-II型胶原纤维表达增加而MMP-3表达降低时，组织增厚，形成瘢痕组织［10］。

MMP-3的表达在转录水平受到启动子基因调节，近年研究发现人类MMP-3基因启动子区域1171位点存在5A和6A两个等位基因，有研究证实5A/6A多态性造成MMP-3基因转录活性不同，5A纯合子的蛋白表达是5A/6A杂合子的4倍，而6A纯合子则比5A/6A杂合子低2倍［11］。不同基因型对心血管疾病的作用亦不同，我们的资料显示5A基因型比6A基因型有较大的左室重量和左室重量指数，室间隔和左室后壁在5A基因型似乎比6A基因型更厚。携带5A基因型高血压患者发生左室肥厚的可能性是携带6 A基因型高血压患者的2倍。我们分析原因可能因为5A基因型MMP-3活性表达较高，引起基质胶原成份降解，破坏正常的间质支持结构，破坏了心肌间质纤维胶原合成和降解之间的动态平衡，使心脏重量增加，心肌纤维化和肥大。但是不同人种、不同研究人群MMP-3基因多态性对心血管的影响不尽相同，一项Meta分析显示欧洲人群携带5A等位基因者心血管病的危险下降，而东亚人群正好相反，携带5A等位基因者心血管病的危险性升高［12］。这可能与欧洲人群和亚洲人群5A/6A等位基因频率相差较大有关，另一种可能是存在其它位点的基因和一些未知因素的交互作用，因此，对于MMP-3基因多态性与心血管病发生、发展的关系，还需从不同角度进行深入的研究。

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