大鼠心肌解剖无复流现象中中性粒细胞的浸润和GDF-15的动态表达

潘坤颖， 刘千萍， 周 欣， 姜铁民， 李玉明， 张 梅△

无复流(no-reflow)是指心外膜冠脉闭塞减轻或解除后，缺血心肌组织并未恢复有效再灌注，微循环血流仍不能完全恢复正常的现象。目前，其发生机制尚不完全清楚。研究发现，损伤区大量中性粒细胞聚集在无复流延展中起重要作用［1］。生长分化因子 15(growth differentiation factor 15，GDF-15)是应激反应性因子，在正常心肌组织几乎不表达，具有抗凋亡、抗肥大、抑制单核巨噬细胞活化等心肌保护作用［2-3］。本实验通过动物模型模拟临床急性心肌梗塞后经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)再通治疗，研究无复流现象中中性粒细胞浸润情况和GDF-15的动态表达。

材料和方法

1 动物分组及材料

雄性Wistar大鼠144只(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，体重250～280 g)，随机分为I/R组和sham组各72只。I/R组采用开胸冠状动脉左前降支结扎方法，缺血60 min后分别再灌注 2 h、4 h、6 h、12 h、24 h 和 7 d，建立心肌缺血/再灌注损伤模型［4-5］，每个时点12只，其中6只随机进行染色，其余6只用于分子生物水平检测。Sham组只穿线不结扎。术后大鼠给予自由饮食，于不同时点取材:检测心肌组织中GDF-15 mRNA及蛋白表达和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性;取心室心肌进行石蜡包埋切片，HE染色大体评估心肌损伤情况;硫磺素S(thioflavin S，Sigma)、酞菁蓝(phthalocyanine blue，郑州勤实染料公司)和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)等。

2 方法

2.1 模型制备 0.4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，气管插管，接呼吸机、心电图。采用胸外结扎法，Y形线结扎左冠状动脉，诱导缺血1 h后，剪断结扎线，完成再灌注［2］。缺血时，心肌局部变暗，活动减弱，心电图ST-T呈明显上抬。再灌注时，心肌局部搏动恢复，心电图有不同程度的坏死性Q波及ST段回落［3］。

2.2 基因水平检测 再灌注不同时间取材，迅速分离并取梗死及梗死周边区心肌组织，行RNA提取，方法按照Trizol试剂盒说明书的操作步骤进行。Real-time PCR法检测GDF-15 mRNA的表达。引物序列 GDF-15 上游引物 5’-GACCTAGGTTGGAGCGACTG-3’，下 游 引 物 5’-TAAGAACCACCGGGGTGTAG-3’。β-actin 上游引物 5’-TACCACATCCAAGGAAGGCAGCA-3’，下 游 引 物 5’-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCA-3’。实验重复3次，复孔3个。以公式2－ΔΔCt计算目的基因相对于内参照基因的表达量。

2.3 MPO活性检测 取梗死及梗死周边区心肌组织置于匀浆器内，剪碎，制备匀浆，然后以3 000 r/min的速度离心15 min，取上清液置管封存冷冻。测定方法按大鼠MPO试剂盒(上海江莱生物公司)说明进行，单位:U/g湿片。

2.4 无复流面积 再灌注不同时间后，自右颈总动脉逆向注入1%硫磺素S 0.5 mL，再次结扎冠状动脉，再经右颈总动脉注入2%酞菁蓝溶液0.8 mL，染色均匀后取出心脏，自结扎线以下，水平切成约2 mm的薄片，荧光显微镜下观察无复流区域并采集图像，然后将缺血心肌片用0.5%TTC(pH=7.4)溶液避光孵育(37℃)15 min，采集图像，IPP软件分析并计算无复流和梗死心肌面积。

2.5 免疫组化染色 大鼠心肌组织石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液进行抗原热修复20 min，3%的过氧化氢封闭内源性过氧化酶，经0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液洗涤后分别加入GDF-15Ⅰ抗(按1∶300稀释)，后续步骤按ABC法染色试剂盒操作说明进行，DAB显色。目的切片再经苏木素复染，脱水、透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察大鼠心肌组织中细胞着色情况。每只大鼠心肌取10张切片，采用二级计分法计数阳性细胞。按阳性细胞数量计分+细胞着色程度计分，算出总分后取均值，进行统计分析。

2.6 HE染色 心肌切片经4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、浸蜡、包埋，制成5 μm厚石蜡切片，进行HE染色，光学显微镜下观察心肌组织损伤及中性粒细胞浸润情况。

3 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，统计学处理采用GraphPad Prism 6软件进行分析，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，有显著差异者用SNK(Student-Newman-Keuls)q检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 GDF-15 mRNA及蛋白在损伤心肌组织中的表达

各时点之间，I/R组较sham组GDF-15 mRNA表达量均显著增高，在再灌注2～24 h之间一直保持几乎线性增长趋势，在再灌注24 h时达到峰值，见图1。在组织蛋白水平，I/R组各时点的GDF-15蛋白表达量也均显著高于sham组。I/R组在再灌注后2～6 h时，GDF-15蛋白表达呈现明显快速上调，之后趋势稍缓，再灌注24 h时达峰值，I/R组再灌注7 d时依然维持较高表达，见图2。

Figure 1.Up-regulation of GDF-15 mRNA in rat myocardial tissues after cardiac I/R.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group at each time point.图1 大鼠心脏I/R后心肌组织GDF－15 mRNA的表达上调

Figure 2.Immunohistochemical analyses of GDF-15 protein expression in rat myocardial tissues after cardiac I/R(× 200).Mean ± SD.n=6.＊＊ P ＜ 0.01 vs sham group at each time point.图2 免疫组化分析大鼠心脏I/R后心肌组织GDF-15蛋白的表达

2 心肌组织MPO活性的检测

I/R组各时点之间相比有统计学差异(P＜0.05)，且各时点MPO活性较sham组均有显著升高，见图3。

3 大鼠心肌染色结果

I/R组缺血面积各时点间无统计学差异(P＞0.05)，见图4。Sham组各时点无缺血、梗死、无复流发生。I/R组，随再灌注时间的延长梗死面积逐渐增大，但在再灌注前3个时点变化明显。无复流面积也是在再灌注前3个时点内表现为较明显的扩大延展趋势，在延展进程中，扩展速度在再灌注6 h后几乎进入平台期，提示在再灌注6 h之内可能是减少无复流发生及梗死的关键，见图5。

Figure 3.MPO activity in rat myocardial tissues after cardiac I/R determined by ELISA kit.Mean ± SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham group at each time point.图3 ELISA试剂盒检测大鼠心脏I/R后心肌组织中MPO的活性

Figure 4.Risk area of the rat hearts after I/R in I/R group.VWA:ventricular wall area.Mean ± SD.n=6.图4 I/R组大鼠心脏I/R后心肌缺血面积

4 MPO活性与GDF-15蛋白表达的相关性分析

由于中性粒细胞的浸润主要在炎症损伤发生后的24～48 h之间明显，故取I/R组前5个时点观察，以各时点内GDF-15蛋白表达的阳性积分均值¯x为变量x，以各时点内MPO活性值的均值¯y为变量y绘制散点图。随着GDF－15表达增高，MPO活性也随之降低，即中性粒细胞浸润量也趋于减少。MPO活性与 GDF-15表达呈负相关(r=－0.9895，P＜0.01)，提示GDF-15可能参与抑制无复流的发生和延展过程。

5 HE染色结果

I/R组心肌微血管内弥漫分布着中性粒细胞，周围局部可见大片心肌凋亡坏死，其中以再灌注2 h、4 h和6 h时较明显。在再灌注24 h后，心肌细胞大片死亡，组织间隙明显。Sham组只在穿线部位可见轻微损伤，见图6。

讨 论

Figure 5.No-reflow and infarct areas of the rat hearts after I/R in I/R group(thioflavin S，phthalocyanine blue and triphenyltetrazolium chloride staining).In the left figures of the upper panel，fluorescence area:flow area;no fluorescence area:no-reflow area.In the right figures of the upper panel，blue:non-ischemic area;brick red:ischemic area;pale:infarct area.Mean ±SD.n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs R2h.图5 I/R组大鼠心脏I/R后心肌无复流面积和梗死面积

Figure 6.Pathological changes of rat myocardial tissues(HE staining，×200).图6 大鼠心肌组织的病理学变化

PCI是急性心肌梗死最主要的再灌注手段，能显著改善这类患者的近远期预后。然而，在ST段抬高型急性心肌梗死患者行PCI术后，无复流的发生率高达约5%～50%，且与恶性心律失常、心衰、心源性猝死密切相关［6］。无复流的发生机制众多，其中，中性粒细胞激活、浸润、脱颗粒可能是心肌缺血再灌注损伤众多机制的共同效应环节或途径［7］。

GDF-15在无复流现象中的作用目前还未见研究报道。既往研究结果显示:在小鼠心肌I/R模型中，心肌组织GDF-15可以通过PI3K/Akt1通路发挥直接抗心肌细胞凋亡作用［3］。最新研究还发现GDF-15可以显著抑制中性粒细胞表面β2-整合素的活化从而减少中性粒细胞募集［8］。

本研究结果显示，大鼠心肌急性缺血/再灌注后出现明显的无复流现象，I/R组心肌梗死及梗死周边区中性粒细胞的浸润量和GDF-15的表达较sham组均明显升高。这提示在无复流延展进程中，有明显的中性粒细胞浸润，同时伴有GDF-15的反应性高表达。在再灌注2～24 h之间，二者不仅有明显的动态变化规律，且存在负相关，提示在大鼠急性心肌缺血再灌后无复流面积的延展中，GDF-15可能能抑制中性粒细胞浸润，进而抑制无复流。

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