尿多酸肽对慢性髓性白血病K562细胞增殖及凋亡的影响

宋 辉,杨 涛,郭媛媛,李峰敏,董 平,于艺冰,刘 文

(河北医科大学附属秦皇岛市第一医院,1.血液科;2.普外科,河北秦皇岛,066000)

慢性髓性白血病(CML)是一种起源于骨髓多能造血干细胞的骨髓增殖性肿瘤,特征性费城(Ph)染色体和BCR/ABL融合基因是其标记性改变,临床以粒细胞增多为突出表现,伴有乏力、体质量下降、脾肿大等症状[1]。20世纪末,临床主要采用伊马替尼治疗CML,但由于其具有耐药性,可产生副反应,且价格昂贵,导致很多患者难以从中获益。尿多酸肽(CDA-2)是从健康人尿中获得的具有多种有效成分的抗肿瘤药物,通过直接作用于异常的甲基转移复合酶,从而发挥诱导多种肿瘤细胞凋亡和分化的作用[2-3]。目前,临床上多采用CDA-2治疗非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、原发性肝癌、大肠癌、脑胶质瘤等晚期肿瘤患者,但关于治疗白血病的研究较少。本实验应用不同浓度的CDA-2作用于K562细胞,通过台盼蓝拒染法、吖啶橙(AO)荧光染色及流式细胞术分别观察CDA-2处理前后K562细胞的增殖及凋亡情况。

1 材料与方法

1.1 材料

K562细胞由秦皇岛市第一医院中心实验室提供,CDA-2注射液(100 mg/100 mL)购自合肥永生制药公司,RPMI 1640培养基购自北京Solarbio公司,胎牛血清(FCS)购自浙江天杭生物科技有限公司,二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司,AO购自美国Sigma公司,AnnexinV-FITC/PI试剂盒购自美国BD公司,噻唑蓝(MTT)试剂购自美国Amerisco公司,磷酸缓冲液(PBS)由本院实验室配制。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将K562细胞复苏后按常规悬浮培养于含10%FCS的RPMI1640培养液中,培养条件为37℃、饱和湿度、5%CO2。每周传代2～3次,细胞密度约105/mL,取对数生长期细胞进行实验[4]。

1.2.2 药物的配置及分组:将CDA-2注射液用直径为0.22 μ m 的滤器进行过滤,以RPMI1640培养液倍比稀释各药,放入无菌小瓶中备用。依据预实验结果分成6组:不加药的对照组和加不同浓度CDA-2的5个实验组,CDA-2终浓度分别为 :15.625mg/L 、31.25mg/L 、62.5mg/L、125 mg/L 、250 mg/L 。

1.2.3 细胞计数以及活力测定:台盼蓝拒染法:用75%的酒精清洁细胞计数板,每24 h、48 h及72 h收集经上述不同浓度药物处理的K562细胞,与0.4%台盼蓝染液按1∶1比例混匀,将细胞悬液从盖玻片的边缘加入,在显微镜下计数4个大方格中的活细胞数和死细胞数,死细胞被染成蓝色,而活细胞拒染。实验重复3次,取平均值为最终结果。细胞总数=(实际细胞数/4)×104×2×10,计算增殖抑制率,增殖抑制率=(1-加药组活细胞总数/对照组活细胞数)×100%。

1.2.4 荧光染色观察细胞形态:采用AO单染法 ,取150μ L细胞悬液 ,予PBS洗涤后离心10 min,加入AO 5 μ L,再次离心 10 min后去上清,取上述染色液1滴,滴在洁净玻片上,加盖玻片后立即于400 nm波长的紫外荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡:采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法,常规收集经上述 2组K 562细胞1mL(约106个细胞),于离心机上以1000 rpm/min的速度离心10 min,弃上清,加入1mL的冷PBS,轻轻震荡 ,于离心机上以1300 rpm/min的速度离心6 min,弃上清,重复2次后将细胞重悬于1 mL Bingding Buffer中,取100 μ L(含细胞数约为 105个),加入 AnnexinⅤ-FITC 及PI各 10 μ L,轻轻混匀,避光 ,室温放置15 min,再加入 Bingding Buffer 400 μ L,1 h 内上机检测。以AnnexinⅤ-FITC为横坐标,PI为纵坐标描计流式细胞散点图。

2 结 果

2.1 CDA-2对K562细胞生长的影响

不同浓度的CDA-2作用于K562细胞24 h后,随着药物浓度的增加,细胞增殖的抑制率由(29.32±0.60)%增加至(77.99±0.25)%(P<0.05);CDA-2作用于K562细胞48 h后,随着药物浓度的增加,细胞增殖的抑制率由(36.67±0.54)%增加至(87.65±0.50)%(P<0.05);CDA-2作用于K562细胞72 h后,随着药物浓度的增加,细胞增殖的抑制率由(39.37±1.06)%增加至(98.17±0.82)%(P<0.05),说明CDA-2对K562细胞的抑制作用呈剂量依赖性。同一浓度的CDA-2(250 mg/L浓度梯度)作用于K562细胞 24、48、72 h,细胞增殖抑制率分别为(77.99±0.25)%、(87.65 ±0.50)%、(98.17±0.82)%,差异有统计学意义(P<0.05),但CDA-2浓度为62.5 mg/L时,各时间段细胞增殖抑制率无显著差异(P>0.05),提示CDA-2在31.25 mg/L以下浓度时,对K562细胞生长抑制作用较弱。见表1。

2.2 细胞形态学改变

AO荧光染色观察细胞形态:未经药物处理的对照组为正常活细胞,圆形,核呈黄绿色均匀荧光,胞质呈橘红色荧光。随着药物浓度的增加,可见细胞体积逐渐变小,细胞形态不规则,核呈致密的黄绿色荧光,甚至核固缩成致密团块,可见黄绿色碎片,见图1。

表1 C DA-2作用于K562细胞的增殖抑制率(,n=3)

表1 C DA-2作用于K562细胞的增殖抑制率(,n=3)

CDA-2浓度(mg/L) 24 h 48 h 72 h F P 15.625 29.32±0.60 36.67±0.54 39.37± 1.07 151.010 0.0031.250 38.32±0.50 42.95±0.72 48.70± 0.64 137.990 0.0062.500 50.57±0.63 70.90±0.63 78.64±11.52 13.624 0.07125.000 73.52±0.70 80.25±1.02 86.33± 1.12 121.250 0.00250.000 77.99±0.25 87.65±0.51 98.18± 0.81 639.450 0.00

图1 荧光染色细胞形态

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

CDA-2作用K562细胞24 h,早期凋亡细胞占0.8%,晚期凋亡细胞占4.3%;作用K562细胞48 h,早期凋亡细胞占1.3%,晚期凋亡细胞占6.8%;作用K562细胞72 h,早期凋亡细胞占3.5%,晚期凋亡细胞占11.5%,提示CDA-2处理K562细胞,随着作用时间的延长及药物浓度的增加,存活细胞逐渐减少,凋亡细胞及死亡细胞逐渐增加。见图2。

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡

3 讨 论

CML是血液系统常见的恶性肿瘤,是第一个被证实有特殊获得性染色体(Ph染色体)异常的肿瘤病,自然病程分为相对隐匿的慢性期,随后病情在3～5年内进展迅速,称为加速期,再随之可迅速或经不长的一段时期进入急变期[5],主要治疗包括化学治疗、干扰素、各种酪氨酸激酶(TKI)抑制剂、伊马替尼等药物及造血干细胞移植等[6-7]。19世纪70年代之前,CML被认为是一种不可治愈的疾病。近十年来,特异性的靶向药物TKI及干细胞移植的广泛应用明显提高了CML患者的缓解率及生存期,但在提高生活质量的同时,其耐药性及各种不良反应也逐渐增加,且价格昂贵[8-10]。

CDA-2又名喜滴克,是从健康人尿中分离、提取和纯化得到的含有多种有机酸和多种分子量在6000D以下的多肽组成的无菌水溶液[11]。研究[12-13]证实,CDA-2作为细胞分化诱导剂,可直接作用于异常的甲基转移复合酶,且具有更为广谱的分化诱导作用,不受相应受体的限制,现已成为应用前途最为广阔的药物之一。CDA-2是中国自主研发的新型细胞诱导分化剂,属于非细胞毒性药物,可以诱导肿瘤细胞的凋亡,且毒副作用较低。

本研究通过台盼蓝拒染法计算细胞增殖的抑制率,得出CDA-2可抑制K562细胞增殖,其抑制作用在一定范围内呈剂量和时间依赖性,且CDA-2在31.25 mg/L以下浓度时,对K562细胞生长抑制作用较弱;AO荧光染色发现,随着CDA-2浓度的增加及作用时间的延长,K562细胞出现皱缩变小,核固缩呈均匀的致密物,且细胞碎片增多;流式细胞术显示,CDA-2处理K562细胞,随着作用时间的延长及药物浓度的增加,存活细胞逐渐减少,凋亡细胞及死亡细胞逐渐增加。

综上所述,CDA-2在体外可抑制K562细胞的增殖,并促进其凋亡,减轻患者的经济负担及痛苦,为CML的治疗开辟了一条新途径。

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