一测多评法测定金银花复方制剂中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸

朱粉霞，张亚丽，汪 晶，贾晓斌*

(1.江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药口服制剂释药系统重点研究室，江苏南京 210028;2.中国药科大学中药学院，江苏南京 210009)

中药复方制剂所含成分的复杂性使得单一成分或指标性成分难以整体表达复方制剂的质量，由此提出多指标的质量控制模式。在多指标的质量控制模式中，需要用足够的化学对照品，而现实中对照品的供需矛盾和多指标质控高昂的检测成本反过来又限制了多指标质量控制模式在实际生产、科研、监督中的应用。“一测多评”法(QAMS)是一种用于多指标质量控制的研究思路，目前已用于解决中药质量控制中缺乏对照品这一瓶颈问题，黄连的一测多评标准被2010年版《中国药典》采纳［1］，其他化合物的一测多评研究也被报道［2-5］。超高效液相色谱(UPLC)具有超高压、超高灵敏度、超高分离度等特点，在中药等复杂体系的分离分析上具有明显优势，目前正被越来越广泛地应用于中药复杂体系的研究［6-12］。

金银花复方制剂脉络宁注射液、双黄连口服液和银黄颗粒中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的含有量较高，为其药理活性成分。绿原酸供应量大，价格便宜，且新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸分别为5-咖啡酰、3-咖啡酰和4-咖啡酰奎尼酸类物质，其结构类似，紫外响应接近，然而新绿原酸和隐绿原酸价格昂贵且供应不足，因此考虑用一测多评法进行测定。本实验以绿原酸为内标物，采用UPLC和HPLC两种色谱系统，建立脉络宁注射液、双黄连口服液和银黄颗粒三种金银花复方制剂中绿原酸与新绿原酸和隐绿原酸的相对校正因子，用校正因子计算新绿原酸和隐绿原酸的量，同时对一测多评的计算值与外标法实测值进行比较，评价一测多评法在金银花复方制剂脉络宁注射液、双黄连口服液和银黄颗粒中多指标质量控制中应用的准确性和可行性。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters Acquity超高效液相色谱系统，Empower工作站(美国Waters公司);Agilent 1100高效液相色谱系统，Agilent chemstation工作站(美国Agilent公司)。Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm);Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7μm);Waters SunFire C18(4.6 mm× 250 mm，5μm)，Agilent SB C18(4.6 mm× 250 mm，5μm)。MT5百万分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 材料 脉络宁注射液(金陵药业股份有限公司，批号20111209、20111213)，双黄连口服液(哈药集团三精制药股份有限公司，批号10082627、11031624)，银黄颗粒(江西济民可信药业有限公司，批号111008、110503)。

1.3 试剂 绿原酸(批号110753-200413)购自中国药品生物制品检定所，新绿原酸和隐绿原酸购自成都普瑞科技开发有限公司，纯度按HPLC面积归一化法测定均≥98%。甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，乙酸和磷酸(色谱纯，美国Tedia公司)。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 色谱条件

2.1.1.1 HPLC色谱条件 Waters SunFire C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)和Agilent SB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脱(0～10 min，10% ～20%A;10～20 min，20% ～40%A;20～25 min，40% ～50%A);柱温30℃;体积流量1 mL/min;检测波长 327 nm;进样量 10μL。见图1。

2.1.1.2 UPLC色谱条件1 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，流动相为甲醇(A) －0.1%乙酸水(B)，梯度洗脱(0～2 min，8% ～16%A;2～8 min，16%A);柱温28℃;体积流量0.3 mL/min;检测波长327 nm;进样量2μL。见图2。

图1 对照品和样品的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.1.1.3 UPLC色谱条件2 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，2.7μm)，流动相为甲醇(A) －0.1%乙酸水(B)，梯度洗脱(0～2 min，8% ～16%A;2～10 min，16% ～25%A);柱温28℃;体积流量0.3 mL/min，检测波长327 nm，进样量2μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品适量，分别置25 mL棕色量瓶中，适量甲醇溶解后，以50%甲醇定容至刻度，其质量浓度分别为 1018、1216和 808μg/mL。

2.1.3 供试品溶液的制备

2.1.3.1 脉络宁注射液供试品溶液 精密移取0.5 mL脉络宁注射液，置25 mL棕色量瓶中，以超纯水定容至刻度，过0.22μm微孔滤膜，置棕色进样小瓶中，待用。

图2 对照品和样品的UPLC图Fig.2 UPLC chromatograms of reference substances and samples

2.1.3.2 双黄连口服液供试品溶液 精密移取0.5 mL双黄连口服液，置25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇定容，称定，超声处理30 min，放至室温，以50%甲醇补定失质量，过0.22μm微孔滤膜，置棕色进样小瓶中，待用。

2.1.3.3 银黄颗粒供试品溶液 称取银黄颗粒约0.1 g，置10 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇定容，称定，超声处理30 min，放至室温，以50%甲醇补定失质量，过0.22μm微孔滤膜，置棕色进样小瓶中，待用。

2.1.4 线性关系、定量限(LOQ)及检测限(LOD) 分别精密移取上述各对照品溶液2.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，以50%甲醇定容，制得混合对照品溶液。取混合对照品溶液，以50%甲醇稀释，稀释倍数分别为2倍、10倍、20倍、40倍，得到系列对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜后，置棕色进样小瓶中，依上述色谱条件进样，HPLC色谱柱为Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，UPLC 色谱 柱为 Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，测定峰面积值，以峰面积值(Y)对质量浓度(X)进行线性回归，得到新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的回归方程、相关系数和线性范围;将混合对照品以50%甲醇不断稀释后分析，分别得到3个成分的LOD(S/N≈3～4)和LOQ(S/N≈10～12)，HPLC的结果见表1，UPLC的结果见表2。

表1 新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的HPLC线性回归方程及LOD、LOQ的测定结果Tab.1 Linear regression equation，LOD，and LOQ of 3 phenolic acids by HPLC

表2 新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的UPLC线性回归方程及LOD、LOQ的测定结果Tab.2 Linear regression equation，LOD，and LOQ of 3 phenolic acids by UPLC

2.1.5 精密度试验 取中浓度混合对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，测定新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的峰面积值，计算峰面积的RSD，新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸在HPLC仪器上峰面积RSD分别为0.86%、1.52%、1.23%，在UPLC仪器上峰面积RSD分别为1.13%、1.35%、1.22%，表明两种仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取脉络宁供试品溶液(批号20111209)，0.22μm微孔滤膜过滤后，置棕色进样小瓶中，分别于0、2、4、8、12、24 h进HPLC分析，测定各成分的峰面积值，计算，新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的RSD分别为0.78%、1.15%、0.94%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 分别取脉络宁注射液(批号20111209)、双黄连口服液(批号10082627)和银黄颗粒(批号111008)6份，按2.1.3项下制备供试品溶液，以UPLC和HPLC测定各成分的峰面积值，计算，结果见表3。

表3 重复性数据Tab.3 Reproducibility of the three components

2.1.8 加样回收率试验 分别制备脉络宁注射液(批号20111209)、双黄连口服液(批号10082627)和银黄颗粒(批号111008)各6份，分别精密加入相当于样品含有量的新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸对照品溶液，按2.1.3项下制备供试品溶液，以UPLC测定各成分峰面积值，计算结果见表4。

2.2 校正因子的重现性考察 取系列混和对照品溶液，混合对照品溶液为1号，稀释倍数为2倍、10倍、20倍、40倍的分别为2号、3号、4号和5号，本实验在UPLC上考察Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm)和Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7μm)两种色谱柱，在HPLC上考察Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5μm)和 Agilent SB C18(4.6 mm×250 mm，5μm)两种色谱柱。所得的相对校正因子及其相对标准差见表5，由表可知，不同的仪器及不同型号色谱柱所得的相对校正因子差异并不显著。

表4 回收率数据Tab.4 Recovery tests of the three components

表5 测得相对校正因子Tab.5 RCFs of phenolic acid

2.3 一测多评法与常规外标法比较 分别取脉络宁注射液，双黄连口服液和银黄颗粒，按2.1.3项下制备供试品溶液，以UPLC和HPLC及以上4种不同品牌和型号的色谱柱测定，并用外标法及一测多评法分别计算新绿原酸及隐绿原酸量，将两种方法的计算结果进行比较，以验证QAMS法用于复方金银花制剂中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸质量评价的准确性，见表6。结果表明，常规的外标法实测含量值与一测多评计算的含量值经t检验比较，P＞0.05，表明两种方法测得量没有显著性差异，证明所建立的一测多评法具有较好的可信度。

3 讨论

3.1 关于流动相的考察，在UPLC中，流动相水相中加入0.1%的乙酸即可改善峰型，3种成分达基线分离;在HPLC中，流动相水相中加入0.1%的乙酸时，三种成分未达到基线分离，加入0.1%的磷酸，分离效果明显改善，峰型较好，所以，在UPLC和HPLC中，流动相水相中分别加入0.1%的乙酸和0.1%的磷酸。

表6 外标法和一测多评法测得复方金银花制剂中新绿原酸、隐绿原酸含量Tab.6 Contents of components by external standard method and QAMS

3.2 金银花药材中，绿原酸的含有量较高，《中国药典》规定绿原酸为其指标性成分，而新绿原酸和隐绿原酸含有量较低［13-14］。而在金银花的复方制剂脉络宁注射液、双黄连口服液和银黄颗粒中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸量均较高，以此三种制剂为例，探讨一测多评法在金银花复方制剂质量控制中的可行性和技术适应性，证明了一测多评可用于多种金银花复方制剂中，同时也避免了由于某一成分含有量较低而引起系统误差，在建立的相对校正因子评价中，考察了Agilent1100 HPLC，Waters UPLC 2台液相色谱系统和4根不同品牌、型号的色谱柱，对绿原酸与新绿原酸和隐绿原酸之间相对校正因子的重现性进行考察，结果表明相对校正因子具有良好的重现性，一测多评法测定结果与传统外标法测定结果无显著性差异，说明一测多评可以同时测定复方金银花制剂脉络宁注射液、双黄连口服液和银黄颗粒中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的量。

3.3 《中国药典》2010年版二部附录XIXF药品杂质分析指导原则中规定，已知杂质对主成分的相对校正因子在0.9～1.1范围内，可以用主成分的自身对照法计算含有量，即用主成分作为对照品计算杂质的量。在本实验中绿原酸对新绿原酸和隐绿原酸的平均校正因子分别为1.057和1.014，符合药典要求，且黄连中小檗碱与巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱的相对校正因子在0.9～1.1之间［15］，药典中规定可以用小檗碱作为对照品计算其他4种生物碱的量［1］。酚酸是自然界中的一类重要化学成分，其中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸在很多中药中同时存在，可以用绿原酸作为对照品计算新绿原酸和隐绿原酸的量，以节约成本。

3.4 在脉络宁注射液和双黄连口服液中，咖啡酸的含有量也较高，且其结构与新绿原酸和隐绿原酸结构相似。本实验前期研究中，以咖啡酸为内参物时，其对新绿原酸和隐绿原酸的相对校正因子4个柱子差别较大，推测可能是咖啡酸稳定性较差，导致计算新绿原酸和隐绿原酸量与实测结果误差大于5%。因此，本实验仅选择绿原酸为内参物，放弃以咖啡酸作为内参物。

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