藤菔降压片抗高血压的实验效应

李运伦，朱 梅，程德斌，蒋海强

(1.山东中医药大学附属医院/国家高血压中医临床研究基地，山东济南 250011;2.山东中医药大学，山东济南 250355)

目前具有明确药理学效应和循证医学证据的抗高血压药物以跨国医药集团的化学药物为主，绝大多数不具备我国的自主知识产权，抗高血压中药新药研发相对落后，目前抗高血压中药如牛黄降压丸、珍菊降压片、复方钩藤片和清眩降压片等的市场占有率较低，而且在疗效、工艺、口感和单服剂量等方面也存在明显不足，因此开发抗高血压中药新药依然是当前面临的关键课题。中药有效组分制剂藤菔降压片是以国家高血压中医临床研究基地钩藤莱菔子验方和医疗机构内制剂藤菔降压片(鲁药制字Z20110021)为依据，遵循中药组分配伍的研究思路，获取该复方抗高血压的主要有效组分并应用药理模型研究其配伍比例而研制的中药新药。本研究选择左旋硝基精氨酸(L-nitro-ariginine，LNNA)诱导的高血压大鼠模型为研究对象，以藤菔降压片为干预手段，观察该制剂的抗高血压效应以及对血清内皮素(Endothelin，ET-1)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、肾素(Renin)、血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)和醛固酮(aldosterone，ALD)水平的影响，从而探索其可能的作用机制，以期为临床试验提供依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠68只，体质量165～212 g，购自山东鲁抗医药股份有限公司，合格证书:SCXL(鲁)20080002。

1.2 实验药物

1.2.1 藤菔降压片 藤菔降压片由山东中医药大学药学院周洪雷教授提供，规格为360 mg/片，每片含钩藤总生物碱18 mg和莱菔子水溶性生物碱21.6 mg。使用前生理盐水溶解，分别按照3∶2∶1的比例配制质量浓度为75、50、25 mg/mL混悬液，置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 缬沙坦 北京诺华制药有限公司产品，批号x1041;0.9%氯化钠溶液:山东威高药业有限公司产品，批号2110813021。使用前生理盐水溶解含缬沙坦1.44 mg/mL的混悬液，置4℃冰箱保存备用。

1.2.3 左旋硝基精氨酸(L-NNA)Sigma-Aldrich产品，生理盐水溶解，质量浓度3.05 mg/mL，过滤，除菌，置4℃冰箱保存备用。

1.3 实验试剂 内皮素(ET-1)酶联免疫检测试剂盒、一氧化氮(NO)酶联免疫检测试剂盒、肾素酶联免疫检测试剂盒、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)酶联免疫检测试剂盒、醛固酮(ALD)酶联免疫检测试剂盒，以上产品均为美国R＆DSVSTEMS公司产品。

1.4 实验仪器 ALC—NIBP型清醒大鼠血压心率测定仪，上海奥尔科特生物科技有限公司产品;ALC—HTP动物恒温系统(上海奥尔科特生物科技有限公司);ALC—NIBP无创血压测量分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司);ELX808型酶标仪(美 国 BIO—TEKISTRUMENTS公 司);ME235P电子分析天平(德国赛多利斯公司);DT5—3型低速自动平衡离心机(北京时代北利离心机有限公司)。

2 实验方法

2.1 左旋硝基精氨酸(L-NNA)诱导的高血压大鼠 根据文献记载［1-2］的方法，采用左旋硝基精氨酸7.625 mg/(kg·d)腹腔注射的方法制备高血压大鼠模型，连续用药14 d后，大鼠尾动脉血压明显升高。正常组大鼠给予等量的生理盐水腹腔注射。

2.2 分组方法 将L-NNA诱发的高血压大鼠均按照体质量随机分为5组，即模型对照组、阳性对照组、藤菔降压片高剂量组、藤菔降压片中剂量组、藤菔降压片低剂量组，并选择同批次大鼠腹腔注射等量生理盐水作为正常对照组。

2.3 给药方法 阳性对照组给予缬沙坦混悬液2.88 mg/(200 g·d)，藤菔降压片高剂量组给予150 mg/(200 g·d)，藤菔降压片中剂量组给予100 mg/(200 g·d)，藤菔降压片低剂量组给予50 mg/(200 g·d)，正常对照组和模型组给予等量的生理盐水，给药途径为灌胃，每周给药6 d，连续给药4周。每周测量体质量1次，并根据体质量的变化调整给药量。

2.4 检测指标

2.4.1 单次给药后24 h各组大鼠清醒状态尾动脉血压和心率的检测 采用无创性尾动脉脉搏间接测压法。

2.4.2 连续给药后4周各组大鼠清醒状态尾动脉血压和心率的检测 采用无创性尾动脉脉搏间接测压法。

2.4.3 连续给药4周后各组大鼠血清内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、肾素、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)水平的检测 采用酶联免疫吸附法。

3 实验结果

3.1 单次给药后24 h血压和心率的比较

3.1.1 单次给药后24 h收缩压变化的比较 与治疗前比较，给予藤菔降压片高剂量、中剂量和低剂量后2 h即有降压效应，至6 h达到峰值，与治疗前相比均有显著差异(P＜0.05)，3组降压的最大幅值分别为(12.2±2.8)mmHg、(9.4±3.6)mmHg和(10.1±1.8)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，至24 h后血压逐渐恢复至给药后2 h的水平(P＞0.05)。给予缬沙坦后收缩压的变化趋势与藤菔降压片接近，介于高剂量组和低剂量组之间;高剂量组降压效应多优于中剂量组和低剂量(P＜0.05)。见表1。

表1 单次给药后24 h收缩压变化(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)Tab.1 24 h systolic blood pressure changes after a single dose(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)

表1 单次给药后24 h收缩压变化(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)Tab.1 24 h systolic blood pressure changes after a single dose(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)

注:与给药前比较，◇P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05;与缬沙坦组比较，▲P＜0.05;与高剂量组比较，●P＜0.05;与中剂量组比较，▲P＜0.05

24 h正常组 12 137.4±2.4※ 138.7±3.4※ 137.4±1.4※ 136.9±1.8※ 136.6±2.4※ 140.1±2.1组 别 动物数/只 给药前 给药2 h 给药4 h 给药6 h 给药8 h 给药※模型组 12 184.2±1.6 183.2±2.6 183.5±1.8 183.4±2.0 183.3±1.4 181.5±2.4缬沙坦组 11 183.3±1.9 178.9±1.4◇※ 174.1±1.6◇※ 172.1±4.1◇※ 174.8±2.3◇※ 177.6±1.5◇※高剂量组 11 183.6±2.1 177.9±2.6◇※ 173.9±1.3◇※▲ 171.5±3.7◇※ 174.4±2.9◇※ 177.8±1.8◇※中剂量组 11 182.2±2.1 178.8±2.4◇※ 174.8±0.9◇※● 172.8±2.7◇※ 175.2±2.7◇※ 178.5±1.8◇※低剂量组 11 183.4±1.9 180.3±2.7◇※● 175.1±0.9◇※▲ 173.3±1.9◇※ 174.3±1.8◇※ 178.5±1.6◇※

3.1.2 单次给药后24 h舒张压变化的比较 与治疗前比较，给予藤菔降压片高剂量、中剂量和低剂量后4～8 h有明显的降压效应(P＜0.05)，3组降压的最大幅值分别为(6.2±3.4)mmHg、(7.6±6.6)mmHg和(8.1±7.9)mmHg。给予缬沙坦后舒张压的变化趋势与藤菔降压片接近，介于大剂量组和小剂量组之间;各剂量组降低舒张压的效应无明显差异(P＞0.05)。见表2。

表2 单次给药后24 h舒张压变化(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)Tab.2 24 h diastolic blood pressure changes after a single dose(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)

表2 单次给药后24 h舒张压变化(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)Tab.2 24 h diastolic blood pressure changes after a single dose(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)

注:与给药前比较，◇P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05;与缬沙坦组比较，▲P＜0.05;与高剂量组比较，●P＜0.05;与中剂量组比较，▲P＜0.05

24 h正常组 12 104.0±4.5※ 105.2±3.8※ 104.1±2.8※ 100.9±4.3※ 100.6±3.7※ 103.1±5.1组 别 动物/只 给药前 给药2 h 给药4 h 给药6 h 给药8 h 给药※模型组 12 137.2±4.8 136.6±4.9 133.6±7.9 136.1±3.3 134.8±4.0 138.4±4.9缬沙坦组 11 134.9±5.1 133.3±4.9※ 130.4±2.5◇ 129.6±4.1◇※ 131.9±4.0 134.4±5.2※高剂量组 11 135.6±3.6 134.2±5.4 129.4±3.7◇※ 129.3±3.9◇※ 129.3±4.2◇※ 133.7±3.9※中剂量组 11 136.5±3.8 135.8±3.9 128.9±7.1◇※ 131.6±5.2◇※ 129.7±6.4◇※ 135.9±2.3低剂量组 11 136.7±4.6 135.8±4.5 128.6±5.7◇※ 131.1±4.5◇※ 131.7±4.2◇ 134.9±4.9※

3.1.3 单次给药后24 h心率的比较 与治疗前比较，给予藤菔降压片高剂量、中剂量和低剂量后心率呈降低的趋势，多无显著性改变(P＞0.05)。给予缬沙坦后心率变化趋势与藤菔降压片无显著变化(P＞0.05);各剂量组之间，给藤菔降压片后心率变化无明显规律。见表3。

表3 单次给药后24 h心率变化(，min)Tab.3 24 h heart rate changes after a single dose(，min)

表3 单次给药后24 h心率变化(，min)Tab.3 24 h heart rate changes after a single dose(，min)

注:与给药前比较，◇P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05;与缬沙坦组比较，▲P＜0.05;与高剂量组比较，●P＜0.05;与中剂量组比较，▲P＜0.05

24 h正常组 12 377.6±43.5 395.4±27.5 381.2±28.8 365.6±2组 别 动物/只 给药前 给药2 h 给药4 h 给药6 h 给药8 h 给药374.9±32.9 369.3±26.94.4 357.5±41.1 381.2±22.5模型组 12 408.0±36.5 395.9±41.3 372.7±44.4 397.5±50.2 363.7±32.9 376.6±24.4缬沙坦组 11 388.3±25.5 405.2±60.3 386.2±25.5 374.6±21.1 383.1±30.8 373.7±48.4高剂量组 11 375.6±47.6 389.4±55.1 368.3±63.8 389.3±28.6 353.2±35.8▲ 351.1±82.9中剂量组 11 360.2±40.4 371.8±49.9▲ 371.8±54.0 357.0±31.8※● 381.9±44.7● 365.4±45.0低剂量组 11 366.3±35.4 391.7±38.5 383.2±24.9 372.4±37.0※

3.2 连续给药4周各组血压和心率的比较

3.2.1 连续给药4周各组收缩压的比较 与治疗前比较，给予藤菔降压片高剂量、中剂量和低剂量1周、2周、3周和4周后均有明显降压效应(P＜0.05)，在给药4周降压幅度分别达(21.8±2.6)mmHg、(20.1±2.0)mmHg和(19.9±2.3)mm-Hg。给予缬沙坦后降压效应在给药2周、3周、4周优于低剂量组(P＜0.05)。各剂量组之间，中剂量组降压的效应优于低剂量组(P＜0.05)，给药4周高剂量组降压效应优于低剂量组(P＜0.05)。见表4。

表4 连续给药4周收缩压的变化(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)Tab.4 Systolic blood pressure changes in 4 weeks consecutive administration(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)

表4 连续给药4周收缩压的变化(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)Tab.4 Systolic blood pressure changes in 4 weeks consecutive administration(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)

注:与给药前比较，◇P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05;与缬沙坦组比较，▲P＜0.05;与大剂量组比较，●P＜0.05;与中剂量组比较，▲P＜0.05

组 别 动物/只 给药前 给药1周 给药2周 给药3周 给药4周正常组 12 137.4±2.4※ 137.4±1.9※ 136.8±1.4※ 137.7±1.2※ 138.3±2.3※模型组 12 184.2±1.6 181.1±1.3 184.3±1.0 183.1±2.0 182.2±2.1缬沙坦组 11 183.3±1.9 173.7±1.6◇※ 168.0±1.6◇※ 164.1±1.4◇※ 160.9±0.8◇※高剂量组 11 183.6±2.1 174.1±1.0◇※ 168.6±1.2◇※ 164.8±1.1◇※ 161.9±1.2◇※中剂量组 11 182.2±2.1 172.8±1.7◇※● 168.0±1.0◇※ 164.4±0.7◇※ 161.9±1.0◇※低剂量组 11 183.4±1.9 174.2±0.6◇※▲ 169.2±1.3◇※▲▲ 165.7±0.8◇※▲▲ 163.6±1.1◇※▲●▲

3.2.2 连续给药4周各组舒张压的比较 与治疗前比较，给予藤菔降压片后高剂量、中剂量和低剂量组均有明显降低舒张压效应(P＜0.05)，在给药4周降压幅度分别达(14.9±5.3)mmHg、(14.5±6.1)mmHg和(15.3±6.1)mmHg。给予缬沙坦后舒张压的变化趋势与藤菔降压片接近，降压效应无明显差异。各剂量组之间，在给药3周中剂量组的降压效应优于低剂量组(P＜0.05)。见表5。

表5 连续给药4周舒张压变化(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)Tab.5 Diastolic blood pressure changes in 4 weeks consecutive administration(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)

表5 连续给药4周舒张压变化(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)Tab.5 Diastolic blood pressure changes in 4 weeks consecutive administration(，mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)

注:与给药前比较，◇P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05;与缬沙坦组比较，▲P＜0.05;与高剂量组比较，●P＜0.05;与中剂量组比较，▲P＜0.05

组 别 动物/只 给药前 给药1周 给药2周 给药3周 给药4周正常组 12 103.9±4.5※ 104.3±3.2※ 102.3±3.1※ 101.5±2.5※ 102.8±2.3※模型组 12 137.2±4.8 134.1±3.0 137.5±2.1 137.3±3.0 134.1±4.2缬沙坦组 11 134.9±5.1 131.7±4.4 126.9±4.3◇※ 128.4±3.4◇※ 122.4±3.1◇※高剂量组 11 135.6±3.6 130.6±3.5◇※ 127.0±5.1◇※ 127.1±4.4◇※ 120.7±4.1◇※中剂量组 11 136.5±3.8 129.8±4.1◇※ 126.9±3.4◇※ 126.2±4.6◇※ 122.1±5.2◇※低剂量组 11 136.7±4.6 131.5±3.2◇※ 129.3±3.8◇※ 128.9±3.8◇※▲ 121.4±3.8◇※

3.2.3 连续给药4周各组心率的比较 与治疗前比较，给予藤菔降压片大剂量、中剂量和小剂量后心率无明显降低效应(P＞0.05)。给予缬沙坦后心率的降低幅度与藤菔降压片无明显差异(P＞0.05)。各剂量组之间，降低心率效应无明显差异(P＞0.05)。结果见表6。

表6 连续给药4周心率变化(，min)Tab.6 Heart rate changes in 4 weeks consecutive administration(，min)

表6 连续给药4周心率变化(，min)Tab.6 Heart rate changes in 4 weeks consecutive administration(，min)

注:与给药前比较，◇P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05;与缬沙坦组比较，▲P＜0.05;与高剂量组比较，●P＜0.05;与中剂量组比较，▲P＜0.05

组 别 动物/只 给药前 给药1周 给药2周 给药3周 给药4周正常组 12 377.6±43.6 339.9±42.2 343.5±62.8 351.8±89.7 385.6±32.96.4 373.8±45.6模型组 12 408.0±36.5 371.7±50.6 350.8±31.4 368.8±21.7 351.7±54.4缬沙坦组 11 388.3±25.5 355.4±30.2◇ 369.2±26.2◇ 333.2±71.6◇ 367.4±55.2高剂量组 11 375.6±47.6 373.1±33.4 366.4±30.2 350.5±60.0 357.9±45.1中剂量组 11 360.2±40.4 376.9±36.5 381.5±66.7 368.1±47.3 383.8±60.4低剂量组 11 366.3±35.4 367.3±61.8 377.4±70.4 363.6±3

3.4 连续给药4周各组大鼠血清ET-1、NO、肾素、AngⅡ和ALD水平的比较 与正常组比较，模型组血清ET-1和ALD水平无明显变化(P＞0.05)，模型组血清NO水平显著降低(P＜0.05)，血清肾素和AngⅡ水平显著升高(P＜0.05)，说明血循环ET-1和ALD不是形成该高血压模型的病理机制，而血液NO、肾素和AngⅡ参与了该高血压模型的病理进程。与模型组相比，中剂量组血清NO水平显著升高(P＜0.05)，仍低于缬沙坦组(P＜0.05)。与模型组相比，高、中、低剂量组血清肾素水平均显著降低(P＜0.05)，而且劣于缬沙坦组(P＜0.05)。与模型组相比，高、中、低剂量组血清AngⅡ水平均显著降低(P＜0.05)，而且高、中剂量组与缬沙坦组相当(P＞0.05)，高剂量组效应优于低剂量组(P＜0.05)。结果见表7。

表7 连续给药4周各组大鼠血清ET-1、NO、肾素、AngⅡ和ALD水平的比较()Tab.7 Comparison of serum ET-1，NO，renin，AngⅡ and ALD content in 4 weeks consecutive administration()

表7 连续给药4周各组大鼠血清ET-1、NO、肾素、AngⅡ和ALD水平的比较()Tab.7 Comparison of serum ET-1，NO，renin，AngⅡ and ALD content in 4 weeks consecutive administration()

注:与给药前比较，◇P＜0.05;与模型组比较，※P＜0.05;与缬沙坦组比较，▲P＜0.05;与高剂量组比较，●P＜0.05;与中剂量组比较，▲P＜0.05

组 别 动物/只 ET-1/(ng·L－1) NO/(μmol·L－1) 肾素/(U·L－1) AngⅡ/(ng·L－1) ALD/(ng·dL－1)正常组 12 64.50±2.37 10.36±3.46※ 48.767 ±6.64※ 63.01±9.39※90.97±12.01模型组 12 65.69±1.15 6.42±1.84◇ 63.52 ±12.09◇ 95.43±15.95◇ 97.21±20.05缬沙坦组 11 64.35±1.68 10.37±2.55※ 61.92 ±5.47 63.20±11.02※ 89.22±13.67高剂量组 11 65.97±1.15 7.73 ±1.85▲ 49.06±10.89※▲ 65.99±10.86※ 93.52 ±13.46中剂量组 11 64.44±3.60 8.27 ±1.16※▲ 48.01±7.62※▲ 70.65±13.20※ 91.29 ±14.51低剂量组 11 66.29±0.63 6.55±1.64▲▲ 51.10±9.76※▲ 79.23±15.87※▲● 103.41±13.68◇▲

4 讨论

本研究在复习古今文献的基础上，根据高血压的临床特点并总结临床治疗高血压病的经验，提出肝气升发太过、无以制约、妄动奔驰、亢阳上扰是高血压病的重要病机，肝阳上亢证是高血压病常见证候类型［3］，平肝潜阳是治疗高血压病的重要治法。中药钩藤莱菔子验方和医疗机构内制剂藤菔降压片(鲁药制字Z20110021)是治疗高血压病肝阳上亢证的有效复方制剂。方中钩藤味甘、微苦，性微寒，入肝、心包经，轻清气凉，其性上行，功效平肝潜阳，《本草正义》载其“轻清而性甘寒”，《本草纲目》载其“大人头旋目眩，平肝风，除心热”，故善治肝阳上亢之头晕目眩，为方中之君药。莱菔子味辛、甘，性平，归肺、脾、胃经，炒熟能降，其性和平，其味又不峻，长于降逆顺气。《医学衷中参西录》称“此乃化气之品，非破气之品……多服久服，转不伤气”，为方中佐药。故钩藤平肝潜阳，善伐肝之过;莱菔子降逆行气，兼助肝之用，二药相伍，一升一降，一峻一缓，相反相成，使亢阳得潜，清气得升，共奏平肝潜阳之功。现代药理学研究表明，钩藤和莱菔子均具有良好的抗高血压实验效用，其药效物质基础分别为钩藤总生物碱和莱菔子水溶性生物碱［4-7］。以此为研究基础，优选适合药物生产的钩藤总生物碱和莱菔子水溶性生物碱的提取工艺，建立有效部位的质量控制标准，并按照“正交设计-药效测定-偏最小二乘回归建模”的程序［8-9］，以药效学为导向，优选出最佳配伍比例，筛选合适辅料，完成成型工艺、中试生产并按照《中国药典》要求进行严格的质量控制研究，而且已经证实钩藤总生物碱和莱菔子水溶性生物碱配伍具有良好的抗高血压效应［10］。

左旋硝基精氨酸为一氧化氮合酶抑制剂，通过降低NO合成、诱导血管内皮功能障碍，从而诱导高血压的发生与发展［11］，甚至导致心肌肥大等靶器官损害。故本研究以腹腔注射左旋硝基精氨酸复制高血压大鼠模型，以此为研究平台探讨了藤菔降压片对L-NNA介导的高血压大鼠模型的降压效用，探索其中可能的作用机制。本研究结果显示:无论是单次给予24 h内还是连续给予4周，藤菔降压片对左旋硝基精氨酸介导的高血压大鼠模型均具有良好的降压效应，呈良好的时效和量效关系，而且对心率无明显的影响。血管内皮功能障碍在高血压的发生和发展中起重要作用［12-13］。ET-1是目前已知缩血管作用最强最持久的细胞因子，具有收缩血管、增加外周阻力的作用，而NO是以L-精氨酸为基质经过NO合成酶(NOS)的作用生成的内源性弛缓因子，具有强力的舒张血管、降低外周阻力的作用［14-15］。血清ET-1和NO水平能够反映血管内皮功能，二者的平衡失调参与了高血压的病理进程。因此，降低ET-1、提高NO、调节二者的平衡是抗高血压的有效途径，而藤菔降压片在此有效应表达，能够降低ET-1水平、提高NO水平、改善血管内皮功能，此为其发挥降压作用的重要机制之一。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在高血压形成机制中发挥作用［16-17］，血管紧张素Ⅱ为RAAS系统的主要效应物质，作用于AT1受体，使小动脉收缩，外周血管阻力增加;刺激醛固酮和去甲肾上腺素分泌，使水钠潴留，继而引起血容量增加，以上作用均可使血压升高，是参与高血压发病并使之持续的重要机制。因此，降低血清肾素、血管紧张素Ⅱ及醛固酮的水平、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性是抗高血压的有效途径，而藤菔降压片在此有效应表达，能够降低大鼠血浆肾素和血管紧张素Ⅱ水平，抑制RAAS系统的活性，此为其发挥降压作用的重要机制之一。

综上所述，藤菔降压片具有良好的抗高血压实验效用，其机制与升高NO水平以改善血管内皮依赖性舒张功能、降低肾素和血管紧张素Ⅱ水平以抑制RAAS系统活性有关。至于藤菔降压片更深层次的降压机制尚有待探索。

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