人参附子不同比例配伍对小鼠急性毒性的影响*

周思思 ，马增春 ，梁乾德 ，汤响林 ，王宇光 ，谭洪玲 ，肖成荣，张伯礼，高 月

（1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室，北京 100850；2.安徽医科大学研究生学院，合肥 230032；3.天津中医药大学，天津 300193）

参附汤是临床常用的经典名方，由人参、附子两味组成，补后天之气无如人参，补先天之气无如附子，此参附汤之所由立也。人参具有“回阳气于垂绝，却虚邪于俄顷”之能，附子更可“引补气药行十二经，以追复散失之元阳”。故人参与附子多用于疾病甚笃之时，发挥力挽狂澜、起死回生之功，为气衰微欲脱之要方[1]。现代医学研究表明，治疗心力衰竭的机制主要包括增强心肌收缩力、扩张冠状动脉、减少心肌细胞氧耗量等[2-4]。

宋元明清时期对参附汤有诸多记载，然而在药物用量、用法、主治等方面却不尽相同，人参附子比例为1∶2的有严氏、危氏和元氏参附汤3方，人参附子比例1∶1的有薛氏参附汤。这两种比例下的参附汤主要用于真阳不足、阳虚气虚之证。更多的参附汤是附子用量少于人参，所针对的病证在阳虚气虚加重的基础上，或多或少地伴有阴脱虚寒之象，在药物用量方面，有附子用量下降及人参用量上升的趋势[5]。从药效角度探讨人参附子配伍规律已有文献报道[4]。笔者运用均匀设计和固定附子剂量与人参不同配比两种方法，考察人参附子不同比例配伍对小鼠急性毒性的影响，旨在从毒性角度考察人参附子配伍是否减毒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 KM种小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体质量18～22 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-（军）2007-004。

1.1.2 药材来源 人参（批号20110901，产地东北吉林），附子（批号20120317,产地四川江油）。由军事医学科学院马百平教授鉴定，人参为五加科多年生草本植物人参的干燥根，附子为毛茛科多年生草本植物乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）子根。

1.1.3 仪器 电子调温电热套，98-1-B型，天津市泰斯特仪器有限公司。旋转蒸发器，RE52CS型，上海亚荣生化仪器厂。电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂。SHB-ⅢA循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。电子天平，BS 223S型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药品制备

1.2.1.1 附子提取液制备 取块状附子，粉碎，称质量，置于圆底烧瓶中，加入8倍量去离子水，浸泡8h，待煮沸后加热回流提取30 min，滤过，减压滤液浓缩至实验所需体积，4℃保存，备用。

1.2.1.2 参附汤的制备 取块状附子粉碎、干燥人参粉碎，称质量，按照实验所需比例混匀，分别置于圆底烧瓶中，加入8倍量去离子水，浸泡8 h，待煮沸后加热回流提取30 min，滤过，减压滤液浓缩至所需体积，4℃保存，备用。

1.2.2 附子急性毒性评价 按照国家食品药品监督管理局制定的《药物非临床研究质量管理规范（GLP）》以及《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》要求，参照Bliss等方法进行小鼠急性毒性实验。在预实验的基础上，小鼠常规饲养数天适应环境后，将小鼠按随机数字表法随机均匀分组，分6组，给药剂量间距比值为0.678，小鼠禁食12 h，不禁水，0.04mL/g灌胃给药，观察14d。应用DAS3.0版Bliss法正规LD50统计软件计算半数致死量（LD50）。

1.2.3 附子与人参配伍均匀设计方法

1.2.3.1 剂量的确定 根据药典规定的临床用量，折算成小鼠给药剂量，并根据急性毒性实验结果，附子最大剂量设为LD50，最小剂量设为临床常用安全剂量的最小量。人参最大剂量设为0.5 MTD，最小剂量设为临床最低有效量。各按等比数列依次计算各组剂量[6]。人参最大给药量经实验为80 g/kg，最终确定剂量范围：附子0.60～11.06 g/kg，人参1.21～40.00 g/kg。

1.2.3.2 因素与水平采用均匀设计U7（72）表[7]，将两味药物给药剂量作为考察因素，每个因素各取7个水平，附子与人参配伍均匀设计的考察因素及水平见表1，剂量配比见表2。

表1 附子与人参配伍均匀设计的因素与水平Tab.1 Homogeneous design of Radix Ginseng and Radix Aconiti Lateralis Preparata g/kg

1.2.4 固定附子LD50与人参不同配比的减毒作用研究 固定附子 LD50，人参与附子按照 1∶6，1∶4，1∶2，1∶1，2∶1，4∶1，6∶1 共 7 个比例，分别制成参附汤剂，见表3。为了确保附子的单因素水平，人参与附子的不同比例实验的加水量统一加入700 mL，以消除加水量对附子中毒性成分的溶出影响。煎药方法见表3。附子的剂量为其LD5011.064 g/kg，按照0.4 mL/10 g给药计算得出给药浓度。小鼠常规饲养数天适应环境后，将小鼠按随机数字表法随机均匀分组，分7组，小鼠禁食12 h，不禁水，0.04 mL/g灌胃给药，观察14 d。

表2 附子与人参配伍均匀设计的剂量配比Tab.2 The dose ratio in homogeneous design of Radix Ginseng and Radix Aconiti Lateralis Preparata g/kg

表3 参附汤剂的制备Tab.3 Preparation of Radix Ginseng and Radix Aconiti Lateralis Preparata decoction

1.2.5 统计方法 采用SAS 9.2统计软件，Mathematics7.0软件包，均由军事医学科学院统计教研室提供。对均匀实验结果作逐步回归分析及F检验。

2 实验结果

2.1 急性毒性实验 附子单煎液不同浓度灌胃给药，附子组给药后1 min高剂量组开始出现小鼠死亡，各组小鼠死亡时间主要集中在5～10 min，中毒反应主要表现为抽搐，躁动，大小便失禁，心跳加快等。尸检肉眼下未见主要脏器有明显病变。实验结果见表4。附子单煎液灌胃给药小鼠的LD50（Bliss法）为 11.064 g/kg，95%可信限为 8.961～13.661 g/kg。

2.2 均匀设计实验 均匀设计实验对小鼠的毒性结果见表5，利用SAS软件对实验结果进行回归分析，得到拟合回归方程为z=0.0493x-0.00166xy，x：附子给药剂量（k/kg），y：人参给药剂量（k/kg），z：死亡率。该回归方程经F检验，具有统计学意义（P=0.0001）。用Mathematics 7.0软件包计算回归方程在三维空间的分布图（图1），小鼠的死亡率越大，表明药对的毒性越强。由图1看出随着附子给药剂量的增多，小鼠的死亡率呈上升趋势，且随着人参对附子的比例增大，减毒作用呈现增大趋势，统计结果表明，人参与附子配伍具有显著的减毒作用。

表4 附子单煎液灌胃给药小鼠死亡率Tab.4 Mortality of Radix Aconiti Lateralis Preparata decoction by intragastric administration

表5 附子与人参配伍均匀实验对小鼠毒性的影响Tab.5 The influence of homogeneous compatibility of Radix Ginseng and Radix Aconiti Lateralis Preparata on acute toxicity in mice

图1 回归方程在三维空间的分布图Fig.1 Scattergram of regression equation in three dimensions

2.3 固定附子LD50与人参不同配比的减毒作用研究 附子人参不同配比灌胃给药，出现死亡的1，2，3 组里，小鼠的死亡时间集中在 5～30 min，中毒反应仍然表现为抽搐，躁动，大小便失禁，心跳加快等。尸检肉眼下未见主要脏器有明显病变。实验结果见表6。结果表明人参与附子配伍的减毒作用在一定范围内随着人参剂量的增加而增加，尤其在人参∶附子为1∶1及大于1∶1时更明显。从小鼠的死亡时间看，出现死亡时间延迟的现象，这也是人参附子配伍减毒的一个体现。

表6 固定附子LD50与人参不同配比的减毒作用研究Tab.6 The toxicity of fixed dose of Radix Aconiti Lateralis Preparata with different compatibility of Radix Aconiti

3 讨论

附子，辛、甘，大热，有毒。其性刚烈迅捷，通上达下，行表彻里，补火助阳，温通诸经，乃治疗阳虚诸证及寒凝痛证之要药。现代临床广泛用于休克、心脏病、肾病、关节痛、肿瘤等的治疗。其主要成分为剧毒的二萜双酯类生物碱、次乌头碱、乌头碱等乌头类生物碱[8-11]。如何在临床应用中既保证疗效，又尽可能降低其毒性反应，是附子应用研究的关键问题。

附子大毒，人参制约彼此相畏为用,可以起到减毒作用，附子与人参配伍可调正固本以制其毒，人参能增强机体对有害刺激的非特异性抵抗力，显著降低附子毒性，并能对抗附子加快心率和引起心律失常的不良反应[12-13]。人参、附子配伍构成的参附汤始载于《济生续方》，历代医家在此基础上灵活加减有所发挥。人参少于附子用量参附汤主要用于真阳不足、阳虚气虚之证，附子用量少于人参者所针对的病证在阳虚气虚加重的基础上或多或少地伴有阴脱虚寒之象。在药物用量方面，有附子用量下降及人参用量上升的趋势，如在宋代，附子多用1两，明清常降至几钱；而人参则由半两增加至几两，与现在临床应用基本相同[5]。现代对附子的临床用量，权威书籍规定及临床报道也不一致，如2010年版《中华人民共和国药典》载附子用量为3~15 g；云南名医吴佩衡治疗一般性虚寒证时附子用量通常为20~100 g，急性阴阳格拒、阴盛阳虚之危候，则为60~250 g[14]。

均匀设计实验的研究结果表明，随着附子给药剂量的增多，小鼠的死亡率呈上升趋势，且随着人参对附子的比例增大，减毒作用呈现增大趋势。固定附子LD50与人参不同配比的减毒作用研究结果表明，人参与附子配伍的减毒作用在一定范围内随着人参剂量的增加而增加，尤其在人参∶附子为1∶1及大于1∶1时更明显。

人参附子不同比例配伍对小鼠急性毒性影响的实验说明，人参附子配比1∶1为参附配伍减毒作用的分界点，参附汤中人参附子配比小于1∶1主要用于真阳不足、阳虚气虚的危重之证；人参附子配比大于1∶1主要用于阳虚气虚伴有阴脱虚寒之证，现在正以动物心功能和心律不齐为指标，深入考察人参附子不同比例配伍的减毒作用。

[1]邵立立，王均宁，张成博.经方中相制配伍抑减附子毒性探析[J].山东中医药大学学报，2010，34（5）：401－402.

[2]吴美平，董耀荣，熊旭东，等.不同剂量附子对心衰大鼠心室重构作用的实验研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（16）：154－157.

[3]周志天，李翊卫，祝红明.参附注射液对冠心病心力衰竭患者血浆 C 反应蛋白浓度的影响[J].天津中医药，2005，22（3）：209-210.

[4]罗明凤，张三印，黄秀深，等.参附注射液和生脉注射液对心肌细胞Ca2+-ATP酶影响的对比研究[J].天津中医药，2008，25（6）：487-490.

[5]徐 丹，范 颖.参附汤方源考证及其配伍内涵探析[J].中华中医药学刊，2010，28（5）：1062－1063.

[6]陈 奇.中药药理研究方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2006：67，112－118.

[7]周红卫，龙 蓓，林士美.均匀设计及其在药学科研设计中的应用[J].数理医药学杂志，1997，10（3）：251－253.

[8]马增春，周思思，梁乾德，等.基于UPLC/Q-TOF-MS分析人参附子药对配伍的化学成分变化[J].药学学报，2011，46（12）：1488－492.

[9]Yim KM,Tse ML,Lau FL.Reversible intraventricular conduction defect in aconitine poisoning[J].Singapore Med J,2009,50(8):302-305.

[10]Fujita Y,Terui K,Fujita M,et al.Five cases of aconite poisoning:toxicokinetics of aconitines[J].JAnal Toxicol,2007,31(3):132-137.

[11]王冬梅，王艳宏，李永吉，等.附子毒性、药效物质基础及分析方法研究进展[J].黑龙江医药，2011，24（1）：45－47.

[12]王均宁，刘更生.附子减毒增效配伍方法初探[J].中国中药杂志，2001，26（1）：63－65.

[13]邵国荣，王志刚.浅谈附子的临床运用体会[J].天津中医药，2009，26（2）：132－133

[14]曾茂贵，陈学习.附子药效与毒性影响因素探讨[J].福建中医学院学报，2009，19（4）：30－32.