大鼠大脑中动脉梗死模型的评价标准探讨*

崔景军，何娇君，李 晶，杜元灏

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

脑血管疾病是威胁人类健康的一大难题，随着科学的进步和临床医疗水平的提高，脑血管疾病基础与临床研究不断向更高端更深入的层次发展，对于以动物实验为基础的研究，稳定、可靠的动物模型制备和准确的评定标准是保证实验科学性的前提。本实验通过神经行为学评分法、多普勒经颅血流测量法和 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法相互验证，探讨大鼠大脑中动脉梗死（MCAO）模型成功的评价标准选择。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 5~6周龄Wistar雄性大鼠60只，体质量190～200 g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。根据随机数字表法分为1、2、3、6、9、12、15、18、21、24h10 个时相组，每组 6只。

1.2 仪器与试剂 激光多普勒血流仪（MoorInstruments，DRT－4），牙科钻，小动物脑立体定位仪，恒流泵（沪西 BT－100），孵育箱，数码照相机（Canon IXUS130），10%水合氯醛溶液，TTC（Amresco原装进口），10%甲醛溶液。

1.3 术前准备 线栓为直径0.20 mm鱼线，紧绕在载玻片上，置于孵育箱80℃，1 h。切割后砂纸上打磨，显微镜下观察断端圆钝，包被石蜡成水滴状，浸渍多聚赖氨酸，游标卡尺测量并标记刻度，分别为18、20、22 mm。

10%水合氯醛，3.5 mL/kg，大鼠腹腔注射，麻醉，俯卧位固定，手术常规操作，沿头皮正中纵向2 cm切口，分离皮下组织，剥离骨膜，暴露冠状缝及矢状缝，以冠状缝与矢状缝结合点为原点，冠状缝向后4 mm，矢状缝旁开3 mm，定位后用牙科钻将颅骨磨薄，作为多普勒激光探头测量位点，测量并记录造模前双侧局部脑血流量基值。

1.4 MCAO模型制备 参照Koizumi线栓法[1]，大鼠仰卧位固定，手术常规操作，颈正中切口，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）及颈外动脉（ECA）分别挂线，动脉夹暂时夹闭CCA和ECA，用眼科剪在CCA距分叉近心端3 mm处剪45°切口，插入线栓约18 mm，手感到阻力时停止。结扎CCA、ECA，固定线栓、缝合，测量造模后双重局部脑血流量。

1.5 灌注、取材、TTC染色[2]经3人分别盲法对大鼠进行神经行为学评估并拟定评分后，大鼠10%水合氯醛腹腔深度麻醉（3.5 mL/kg），迅速开胸、开腹暴露心脏、腹主动脉，左心室穿刺插管作为灌注液流入口，剪开右心耳作为灌注液流出口，夹闭胸腹主动脉，5 min内经左心室快速灌注37℃生理盐水l00 mL冲洗。迅速断头取脑，取大鼠视交叉后的脑组织，置-20℃冰冻20 min，至半硬状态。自额叶由前向后作冠状切片（厚2 mm）5等份，脑片放入2%TTC染液中，37℃避光染色20min，每隔5min翻动1次。滤除TTC染液，置于10%甲醛溶液中固定保存。

2 纳入排除标准

2.1 Longa 5分制评分标准 0分：无神经功能缺失症状。1分：轻度局灶性神经功能缺失（不能完全伸展右侧前肢，左侧Horner’s征阳性）。2分：中度局灶性神经功能缺失（提尾悬空时右前肢屈曲、内收，行走时向右侧转圈）。3分：重度局灶性神经功能缺失（站立不稳，向右侧倾倒）。4分：不能自发行走，意识水平降低[3]。评分在1～3分为造模成功。

2.2 激光多普勒脑血流测量纳入排除标准 成功模型：大鼠术后即刻局部脑血流量下降至同侧梗死前测定值的35%以下。以下3种情况为失败模型：ⅰ）MCAO后即刻同侧脑皮质血流量下降，但高于梗死前测定值的35%。ⅱ）MCAO后即刻对侧脑血流量出现急剧下降，提示蛛网膜下腔出血。ⅲ）实验结束后取脑时见有颈内动脉分叉部出血的。

3 结果

神经行为学评分见表1。0分3只，TTC染色阳性1只。1分14只，TTC染色阳性9只。2分35只，TTC阳性34只，其中取脑时见有颈内动脉分叉处出血6只。3分5只，TTC染色阳性5只，其中1只取脑时见有颈内动脉分叉处出血。4分1只，TTC染色阳性，取脑时见蛛网膜下腔出血。

表1 神经行为学评分、激光多普勒脑血流测量、TTC染色结果Tab.1 Results of neuroethology scores,Laser Doppler cerebral blood flow measurement,TTC staining

60只大鼠，麻醉后死亡1只，造模后死亡1只，其余58只MCAO大鼠，经解剖和TTC染色验证，神经行为学评分法对44只MCAO大鼠模型判读准确，准确率为75.86%，结合解剖结果，准确率为86.21%。多普勒脑血流量检测法对51只模型MCAO大鼠模型判读准确，准确率为87.93%。结合解剖结果，准确率为100%。

4 讨论

大脑中动脉供血范围的脑缺血是临床最常见的脑缺血类型，大鼠线栓法MCAO模型制备不开颅、对动物生理功能影响小、梗死效果确切、重复性好、能准确控制缺血及再灌注时间，成为目前研究大鼠MCAO脑缺血的最广泛方法。本课题组采用本法进行了多项研究[4-5]。但因大鼠个体差异、线栓插入深度均会明显影响模型的成功率，因此，适宜的模型评价标准对后续实验的科学性、准确性极其重要。

本实验麻醉采用10%水合氯醛300～350 mg腹腔注射，麻醉起效时间3～5 min，麻醉维持时间30～70 min。采用Longa神经功能缺损评分，尤其是对于脑梗死超急性期模型行为学观察的判断，可能会受大鼠的个体差异影响麻醉的苏醒状态，使准确率降低。TTC是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白，1958年开始用TTC染色检测哺乳动物组织的缺血梗死[6]。TTC的不着色表明细胞进入膜衰竭即不可逆阶段，能反映脑组织中梗死灶的具体情况[7]。研究表明，在永久闭塞非灌流性大脑中动脉缺血模型上，脑血流的阻断可能呈渐进性过程，梗死体积将随时间而增大[8]。TTC染色法在8 h以后大鼠脑梗死模型脑梗死组织的计算标记与体积测量中，得到了普遍应用[9]。但超早期大脑中动脉梗阻后，半暗带的神经细胞尚未处于膜衰竭期[10]，不同区域的脑组织对缺血的敏感性可影响梗死灶出现的最早时间点，从而影响TTC染色对超早期的大脑中动脉梗死模型判读的准确性。另外，已经进行TTC染色的脑组织，会影响进一步检测基因和蛋白的表达变化结果，不适用于后续有对脑组织生物活性要求较高的检测和实验。

本研究结果显示，激光多普勒血流测量法对大脑中动脉梗死模型是否成功的判断具有良好的敏感性和准确性，尤其适用于超急性期大脑中动脉梗死模型选用。选择适合的脑梗死模型纳入排除标准，才能在进一步的实验中更真实的再现大鼠脑缺血生理病理变化，更如实反映指标数据，增强可信度，才能使笔者在脑缺血动物模型基础上所得到的研究结论达到真正意义上的严谨和可信。

[1]Koizumi J,Yoshid Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemia brain edema,a new experimental model ofcerebral embolism inra©eischemia area[J].Srtoke,1986,(8):1.

[2]Khan SH,Baziany A,Banigesh A,et al.Evaluation of an optimal temperature for brain storage in delayed 2,3,5-triphenylte-trazolium chloride staining[J].J Neurosci Methods,2000,98(1):43-47.

[3]Zea-longa E,Weinstein PR,Carlson,et al.Reversible middle artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91.

[4]石 磊，杜元灏.脑梗死急性期局部血流量变化及电针干预效应研究[J].天津中医药大学学报，2012，31（2）：85-87.

[5]李桂平，石 磊，杜元灏，等.脑梗死早期侧支循环重建及电针干预效应研究[J].天津中医药大学学报，2012，31（2）：102-104.

[6]Cole DJ,Drummond JC,Ghazal EA,et al.A reversible component of cerebral injury as identified by the histochemical stain 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)[J].Acta Neuropathologica,1990,80(2):152-155.

[7]Joshi CN,Jain SK,Murthy PS.An optimized triphenyltetrazolium chloride method for identification of cerebral infarcts[J].Brain Res Brain Res Protoc,2004,13(1):11-17.

[8]曹 霞，曹秉振，郭述苏.大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型的时间梗死体积相关研究[J].解放军医学杂志，2000，37（2）：123-124.

[9]Isayama K,Pitts LH,Nishimura MC.Evaluationof 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining to delineate rat brain infarcts[J].Stroke,1991,22(11)：1394-1398.

[10]王志强，张小宁，姜 涛，等.脑梗死大鼠神经功能缺损评分与脑梗死体积的相关性研究[J].中国临床神经科学,2008，16（4）：394-399.