火针干预脊髓损伤大鼠后血清对神经干细胞增殖分化的影响

李 岩 ，周 震 ，程素利 ，焦召华 ，陈 爽

（1.天津市公安医院，天津 300042；2.天津中医药大学第二附属医院,天津 300150；3.天津中医药大学，天津 300193）

脊髓损伤（SCI）是交通事故、工矿事故及自然灾害中常见的、严重危害人类健康的疾病，患者多出现损伤平面以下的感觉、运动障碍及尿便功能异常[1]。目前，国内外对于SCI的治疗研究多集中在具有自我更新和定向分化潜能的神经干细胞（NSCs）上[2]。笔者在临床应用火针多年，发现其对慢性SCI疗效显著[3]。前期研究也发现，火针对于脊髓神经细胞具有保护和抗凋亡作用[4-5]。但火针是否可能通过影响NSCs的增殖及分化产生作用尚不清楚。本课题应用细胞离体培养和血清药理学的方法，就火针干预SCI大鼠后血清对脊髓NSCs增殖分化的影响进行相关研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 1）孕14 d昆明小鼠2只，清洁级。2）健康SD大鼠15只，体质量250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2007－0001，随机分为假手术组、模型组与火针组，每组5只。

1.2 SCI模型动物建立 采用改良的Allen’s法[6]建立急性SCI动物模型。即采用20 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg体质量）腹腔注射将大鼠麻醉，取后正中切口，切除T9棘突、部分T10棘突和部分椎板，暴露硬膜，10 g的铁锤从25 mm高处自由落下，撞击硬膜囊，撞击能量为25mm×10g，损伤直径为2.5mm。与脊髓接触的撞杆底端呈弧状凹陷，直径2.5 mm，与脊髓表面相吻合。撞击成功的标志为大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及身体回缩样扑动，双下肢呈弛缓性瘫痪。假手术组只做T9-T10椎板切除术。术后小心护理饲养，每天挤压排尿3次，直到反射性膀胱排空建立。

1.3 干预方法 火针组选取大鼠脊髓损伤部位上下端的棘突间隙，相当于T7、T8及T11、T12部位，各旁开0.5 cm，共4个穴，8个针刺点，采用快针法火针针刺，每穴仅刺1针，深度为3～5 mm。造模后即行针刺1次，之后每隔24 h针刺1次，共治疗3次。

1.4 目标血清制备 SD大鼠采血前禁食12 h，于第三次针刺后麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，分离血清。56℃灭活30min，220nm滤膜滤过除菌，-20℃保存备用。

1.5 神经干细胞的分离、培养及鉴定 取孕14 d昆明小鼠，无菌取出胎鼠，经D-Hanks液反复冲洗，解剖镜下剥离皮肤、肌肉等组织，眼科剪剪碎脊髓，0.25%胰蛋白酶消化，吸管吹打，200目铜网过滤，离心，弃上清，加入含有 DMEM/F12、2%的 B27、20ng/mL碱性成纤维生长因子（bFGF）、20 ng/mL、表皮细胞生长因子（EGF）、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的生长培养基，以5×105个/mL密度接种入25cm2培养瓶中，置入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。此后每3 d半量换液1次，每7 d左右传代1次。传代培养纯化的细胞经Nestin鉴定,显示Nestin免疫反应阳性，表明所培养的细胞为神经干细胞。

1.6 NSCs增殖及生长状态观察 离心收集传代培养8代的NSCs，吸管机械吹打,分离制备单细胞悬液,显微镜下计数。将细胞接种于12孔培养板,接种密度为 2×105个/mL。

各组NSCs按培养基中所含血清成分的不同共分3组，即假手术组、模型组及火针组。各组培养基均为含10%浓度SD大鼠不同血清成分的DMEM/F12基础培养基（不含B27、rhEGF和rhbFGF），每4孔为同一血清成分培养液。

培养7 d后，拟分孔收集呈球形悬浮生长的细胞，再次机械分离制备单细胞悬液，显微镜下细胞计数。实验重复3次。

1.7 NSCs诱导分化观察 离心收集传代培养8代呈球形悬浮生长的NSCs，吸管机械吹打分离成约含十几个细胞的干细胞小球，分别接种于预先铺有多聚赖氨酸盖玻片的12孔培养板，培养基分别为上述3组含10%不同血清成分的培养基，每4孔为同一血清成分培养液，诱导NSCs分化。实验重复3次。

1.8 免疫荧光染色 细胞贴壁培养7 d后，取各组盖玻片上的细胞，经磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗后，4%多聚甲醛固定30 min，后接常规免疫荧光染色步骤。以β-tubllin标记分化的神经元，4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）标记细胞核，每张玻片采用双盲法选择5个视野计数神经元的比例。

1.9 统计方法 数据统计采用SPSS18.0软件，进行单因素方差分析，两两间均值比较采用Student-Newman-Keuls检验。

2 结果与分析

2.1 各组NSCs增殖及生长情况 在相差显微镜下，细胞接种于12孔培养板后，第1天，模型组细胞死亡较多，假手术组和火针组无明显变化，细胞死亡尚少。各组形成了悬浮的、数量不等、大小不一的细胞团。3 d后，各组细胞多数呈球形且开始贴壁，并发出细小的突起。3组中，火针组细胞最多，开始贴壁时间最早，模型组细胞数最少，贴壁出现最晚。

2.2 各组NSCs分化情况 各组神经干细胞向神经元分化情况见表1和图1。从表1可看出，3组NSCs均出现神经元分化，与模型组及假手术组相比，火针组神经元比例显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 神经干细胞培养7 d后各组NSC分化为神经元的比例（±s）Tab.1 The proportion of NSC differentiated neuron after neural stem cells cultured 7 days（±s）%

表1 神经干细胞培养7 d后各组NSC分化为神经元的比例（±s）Tab.1 The proportion of NSC differentiated neuron after neural stem cells cultured 7 days（±s）%

注：经多因素方差分析，与模型组相比，▲P＜0.05。

组别 n 神经元比例假手术组 5 25.28±1.03模型组 5 14.43±0.85火针组 5 28.22±1.21▲

图1 不同血清作用7 d后，神经干细胞分化情况Fig.1 The differentiation of neural stem cells affected by the different blood serum after 7 days

3 讨论

NSCs为中枢神经系统中的原始细胞，具有自我更新和多潜能分化的特性，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[7-8]。自1992年Renyolds等[9]从成年小鼠纹状体分离得到能在体外不断增殖且可多向分化的NSCs，为中枢系统神经损伤的治疗提供了新思路。

SCI的病理过程分为原发性损伤和继发性损伤，其中神经细胞的病理性凋亡是继发性损伤的关键病理基础[10]，故适当诱导NSCs增殖并向神经元分化以弥补其损失，将成为SCI的潜在治疗方法。

课题组在前期研究中证实，火针能减少SCI大鼠白介素-1β（IL-1β）、Caspase-3、p38MAPK 等凋亡相关蛋白的表达[10]，抑制凋亡细胞发生[11]，表明火针能抑制SCI大鼠炎症反应及细胞凋亡，从而发挥神经保护作用。那么火针在抑制SCI大鼠细胞凋亡的同时，能否通过诱导NSCs增殖并向神经元分化以弥补凋亡的神经细胞，从而治疗SCI？为探讨此问题，课题组设计实施了本次研究。

本研究结果发现，火针干预后的SCI大鼠血清可促进离体状态下的NSCs增殖，与假手术组及模型组相比细胞数目明显增多；从神经元分化角度，火针组神经元分化比例增高，与另两组比较差异具有统计学意义，表明火针干预后的SCI大鼠血清可促进NSCs增殖并可诱导其向神经元分化，这为火针治疗SCI提供了部分实验依据。但本实验仅为离体细胞培养，火针能否对SCI大鼠内源性NSCs的增殖及向神经元分化产生作用及其作用机制，尚需进一步研究证实。

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[3]焦召华，李 岩，程素利，等.火针治疗脊髓损伤后排尿困难13例[A].“针灸临证经验、医案学术研讨会”论文汇编，天津：2012.

[4]孙立明，李 岩，周 震，等.火针对脊髓损伤模型大鼠凋亡细胞的影响[J].针灸临床杂志.2011，27（1）：58－61.

[5]李 岩，程素利，周 震，等.火针对大鼠脊髓损伤后运动功能及BDNF 表达的影响[J].2012，29（6）：545-547.

[6]Khan T,Havey RM,Sayers ST,et al.Animal models of spinal cord contusion injuries[J].Lab Anim Sic.1999,49(2):161-172.

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[11]孙立明，李 岩，周 震，等.火针对脊髓损伤模型大鼠凋亡相关蛋白表达的影响[J].针灸临床杂志.2010，26（12）：49－53.