藏灵菇发酵乳中乳酸菌的分离鉴定及其应用研究

蔚晓敏，程菲儿，张苗青，冯翠萍

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷030801）

藏灵菇是乳白色胶状的颗粒物，源于俄罗斯毕加索高原的一种天然的酸奶发酵剂，属于开菲尔的一个品系［1］，有“西藏雪莲”之称［2］。藏灵菇酸奶有提高免疫力、改善动脉粥样硬化、降低胆固醇、调节肠道菌群和抗疲劳等功效［3～6］。藏灵菇外表上栖息着多种有益微生物，主要是乳酸细菌和酵母菌。由于藏灵菇复杂的菌相在分批发酵过程中稳定性差，直接使用易发生菌相失衡，影响藏灵菇酸奶的品质，不能发挥其应有的价值。因此，对藏灵菇发酵过程中的优势菌进行分离鉴定，可为功能性藏灵菇乳制品研发提供优良菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藏灵菇市售。

1.1.2 纯牛奶

山西农业大学无抗生素牛奶。

1.1.3 培养基

M17培养基（酪蛋白的胰蛋白酶消化物2.5 g，肉的胃蛋白酶消化物2.5 g，大豆的木瓜酶消化物5 g，酵母提取物2.5 g，牛肉膏5 g，β－磷酸甘油二钠10 g，Mg SO40.25 g，抗环血酸0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水950 mL，乳糖溶液50 mL，p H 7.1～7.2）、MRS培养基、明胶液化培养基、硝酸盐还原培养基、产硫化氢培养基、石蕊牛乳培养基、吲哚培养基、糖发酵培养基等。

1.1.4 仪器设备

超净工作台：苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；电子天平：奥豪斯仪器有限公司；CX21FS1型生物显微镜；恒温培养箱：北京东联哈儿仪器制造有限公司；低速离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；NDJ－1型旋转式粘度计：上海舜宇平科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藏灵菇发酵乳的制备

藏灵菇用灭菌水冲洗后，接种2%到85℃、30 min灭菌后冷却的牛乳中，25℃培养24 h。重复活化3次，作为发酵剂备用。

1.2.2 乳酸球菌的分离纯化

挑取藏灵菇发酵乳在M17培养基上平板划线，37℃恒温培养48 h，挑取菌落形态不同的单菌落于液体培养基中培养，再平板划线分离纯化直至镜检为纯培养物。各菌株分别进行涂片革兰氏染色和接触酶实验，将革兰氏染色阳性且接触酶阴性的菌株接种于该斜面培养基上，培养24 h后于4℃冰箱中保藏备用。

1.2.3 乳酸杆菌的分离纯化

用MRS培养基进行分离，42℃恒温培养，分离纯化方法同1.2.2。

1.2.4 乳酸细菌菌属的生理生化鉴定

经革兰氏染色阳性，接触酶阴性，初步确定为乳酸菌。根据显微镜细胞形态观察，将细胞排列呈单个或成对的短或长的杆菌进行明胶液化实验，吲哚实验，硫化氢实验，硝酸盐还原实验和运动实验。将单个、成对或链状排列的球菌进行硝酸盐还原实验和运动实验，两个都为阴性的进行葡萄糖产气实验，6.5%Na Cl和4%Na Cl的需盐实验，10℃和45℃生长实验［7～9］。

1.2.5 乳酸球菌菌属的鉴定

硝酸盐还原阴性，运动实验阴性，葡萄糖不产气，在10℃和45℃及6.5%Na Cl均不能生长的进行乳糖和麦芽糖的发酵实验，以确定乳酸球菌的菌属［8～10］。

1.2.6 乳酸杆菌和乳酸链球菌菌属的鉴定

将明胶液化实验，吲哚实验，硫化氢实验，硝酸盐还原实验均为阴性且不运动的实验菌株各自进行D－果糖，菊糖，葡萄糖，山梨醇，乳糖，蔗糖和麦芽糖的发酵实验，确定乳酸杆菌和乳酸链球菌的菌属［8，9］。

1.3 发酵酸奶菌株的筛选

对分离出的球菌和杆菌通过酸度，粘度和感官评分筛选，用于酸奶的制备。感官评分标准如表1所示。

表1 感官评分标准Table 1 Standards of sensory evaluation

1.4 藏灵菇酸奶复合发酵剂的制备

1.4.1 发酵剂的制备

10 mL新鲜牛乳（试管）→灭菌（121℃，15 min）→冷却（35～40℃）→接种（分离出的菌株）→恒温培养至凝乳→发酵剂

1.4.2 酸奶制备工艺

新鲜牛乳→灭菌（85℃，30 min）→冷却（35～40℃）→接种→培养→后熟（4℃冰箱）

1.5 制备酸奶最优条件筛选

以球杆菌比例，发酵温度，接种量为因素，采用三因素三水平L9（33）正交试验，以其酸度，乙醛，粘度为指标，确定其最佳条件。因素水平见表2。

表2 正交因素水平表Table 2 The factors and levels oforthogonal optimization

1.6 指标的测定方法

1.6.1 酸度的测定

取10 mL待测乳样用0.1 mol·L－1的氢氧化钠滴定，以吉儿涅尔度（°T）为单位。

1.6.2 粘度的测定

根据粘度计的指针旋转速度来测酸奶的粘稠度。

1.6.3 乙醛的测定

将待测乳样与16%的TCA（三氯乙酸）等体积混匀，3000 r·min－1离心20 min，取澄清的上清液25 mL与5 mL 1%Na HSO4溶液加入锥形瓶摇匀，室温放置1 h后，加入1 mL 1%淀粉指示剂，用0.1 mol·L－1碘液滴定至终点（淡蓝紫色，30 s不褪色），再加20 mL 1 mol·L－1Na HCO4，震荡30 s（蓝紫色褪去），用碘液继续滴定至终点，记录消耗碘液体积。并做空白的滴定。测定3次，取平均值，计算乙醛含量［11］。

V1－样品消耗碘液的体积／mL；V2－空白消耗碘液的体积／mL；C－碘液浓度／mol·L－1；0.022－乙醛化学反应基本单位／g；25－乙醛样品的体积／mL。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的鉴定

2.1.1 乳酸菌菌属的鉴定

本研究分离到7株菌株，编号为L1～L7，结果见表3。由表3可见，硝酸盐还原实验皆为阴性，葡萄糖产酸实验皆为阴性且不运动，石蕊牛乳实验中均变红，6.5%的Na Cl实验中都不能生长，4%的Na Cl实验中只有L2、L3、L5、L6和L7可以正常生长，据东秀珠等的常见细菌系统鉴定手册［7］初步确定L1、L4为乳酸链球菌属，L2、L3为乳酸球菌属，L5、L6和L7为乳酸杆菌属。

表3 乳酸菌的菌属鉴定结果Table 3 The results of identification of Lactic acid bacteria

2.1.2 乳酸球菌种间的鉴定

将初步鉴定为乳酸乳球菌属的菌株L2和L3进行乳糖和麦芽糖的发酵产酸实验，均是阳性，根据乳酸细菌分离鉴定及实验方法［9］，确定两个菌株均为乳酸乳球菌乳酸亚种。

2.1.3 乳酸杆菌种的鉴定

对初步鉴定为是乳酸乳杆菌的3株菌株进行糖醇产酸实验，L5和L7菌株对实验糖醇产酸均为阳性，L6菌株对菊糖，葡萄糖，乳糖的发酵产酸为阳性，对蔗糖，D－果糖，山梨醇和的发酵产酸为阴性，根据常见细菌鉴定手册［7］和伯杰细菌鉴定手册［10］确定L5和L7为弯曲乳杆菌，L6为类高菲尔乳杆菌。

2.1.4 乳酸链球菌种的鉴定

将乳酸链球菌属的2株菌株进行糖醇类产酸实验，L1和L4菌株对蔗糖，菊糖，D－果糖，葡萄糖，山梨醇，乳糖，麦芽糖实验均为阳性。据文献初步确定均为唾液链球菌［7～10］。

2.2 菌种筛选试验

由于L1和L4菌株同为唾液链球菌，L2和L3同为乳酸乳球菌乳酸亚种，L5和L7同为弯曲乳杆菌，因此选用L1、L2、L5、L6作为筛选菌株。

由表4可见，L1菌株产酸一般，产粘最高，感官评分较高；L2菌株的产酸一般，产粘偏高，感官评分最高。L5菌株产酸最高，产粘一般，感官评分较高；L6菌株产酸较高，产粘较少，感官评分最低。综合分析后用L1、L2和L5做复合发酵剂，且球菌中L1与L2的比值为1∶1。

表4 菌株的筛选结果Table 4 Result of strain screening

2.3 最佳发酵条件的确定

乙醛是酸奶重要的风味物质，使酸奶具有坚果仁风味，粘度能提高酸奶的稳定性，是组织性状的重要指标，酸度是酸奶的常规指标，因此把乙醛产量，粘度和酸度作为酸奶的检测指标，以此确定最适的发酵条件。

由表5和表6可见，温度对发酵剂酸度的影响较大，差异显著，综合黏度和乙醛产量的指标可知B2为最佳水平，最佳发酵温度为40℃。

表5 正交实验方案及结果Table 5 Orthogonal experi ment methods and results

表6 乙醛的方差分析表Table 6 Analysis of variance table of acetaldehyde

由表5和表7可见，接种量对酸奶中乙醛产量的影响较大，差异非常显著，结合接种量对黏度和酸度的影响，C1为最佳水平，最佳接种量为2.5%。

由表5和表8可见，球菌杆菌的比例对藏灵菇的粘度影响较大，差异显著。由球杆菌比例对乙醛产量和酸度影响的分析，A1为最佳水平，球杆菌比例为2∶1时最佳。

表7 酸度的方差分析表Table 7 Acidity of the anovatable

表8 粘度的方差分析Table 8 Variance analysis of viscosity

3 结论与讨论

藏灵菇发酵乳中存在着多种微生物细胞形态，但本实验仅分离得到7株乳酸细菌，原因可能是所选用的培养基或培养条件只适合这部分菌株的正常生长，或有些乳酸细菌不能在组合培养基上良好生长，这样使得其它部分微生物的分离及进一步的利用受到一定程度的限制。藏灵菇复杂的菌系有待进一步研究。

在划线分离得到菌株的过程中多次出现乳酸球菌整齐排列在酵母菌周围的现象，据周剑忠［1］介绍酵母菌同乳酸细菌为共生关系，但相关研究报道资料很少。乳酸细菌与酵母菌是否有共生关系需要进一步的研究。

本试验共分离到7株乳酸菌，分别为2株乳酸球菌乳酸亚种，2株唾液链球菌、2株弯曲乳杆菌和1株类高加索乳杆菌。

当球杆菌比例2∶1，温度40℃，接种量2.5%时发酵酸奶的效果最好。

［1］周剑忠.藏灵菇微生物分析生态分析及微胶囊化发酵剂的研究［D］.南京农业大学，2005：1－2，48.

［2］周剑忠，董明盛，江汉湖.PCR－DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇发酵过程的优势菌［J］.中国农业科学，2006，39（8）：1632－1638.

［3］刘慧，王世平，冉冉，等.藏灵菇源酸奶复合菌发酵剂对大鼠脂质过氧化的影响［J］.中国食品学报，2010，10（3）：27－32.

［4］齐红霞.藏灵菇发酵乳的抗疲劳作用研究［D］.吉林大学，2008：36.

［5］刘慧，王世平，冉冉，等.藏灵菇源酸奶复合菌发酵剂对肠道菌群平衡的作用［J］.中国食品学报，2011，11（6）：7－12.

［6］刘慧，陈湘宁，李晨，等.藏灵菇酵母菌 M3耐胃肠道逆环境特性及降胆固醇的实验研究［J］.中国农学通报，2009，25（15）：60－63.

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