影响碱提酸沉法提取燕麦蛋白因素的分析

刘建垒，郝利平

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷03080）

燕麦，又称莜麦、玉麦、雀麦、铃铛麦，分为带稃型燕麦（Avena sativa L.）和裸粒型燕麦（Avena nuda L.）两大类，在我国以裸燕麦为主。现代研究表明燕麦具有降血脂、降血糖、免疫增强、抗氧化、益生等多种保健功能［1～3］。燕麦中蛋白质含量最高可达20%，在禾谷类作物中居首位［4］。燕麦蛋白功效比（PER）达2.25～2.38，氨基酸分数（AAS）高达68.2，生物价（BV）为74.5～79.6，均是植物蛋白中的佼佼者［5～7］。燕麦蛋白质含人体8种必需氨基酸，其配比接近FAO／WHO推荐的模式，限制性氨基酸赖氨酸和色氨酸含量相对较高［8，9］，赖氨酸含量为大米和小麦粉的2倍以上，有益于增进智力和骨骼发育，能弥补我国传统膳食结构所导致的“赖氨酸缺乏症”缺陷［10］，色氨酸具有改善睡眠，预防糙皮病、抑郁症和调节情绪等功能，被称为“第二必需氨基酸”［11］。

本研究选用产量高、抗旱性好，适应性强的燕麦新品种晋燕14号为研究对象，用Box－Behnken试验设计对影响碱提酸沉法提取燕麦蛋白的参数进行优化，分析各影响因素及其交互作用对蛋白提取率的影响，以期为燕麦全粉中蛋白质的提取和利用提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕麦：晋燕14号，由山西省农业科学院高寒区作物研究所提供（脱脂燕麦全粉中蛋白质含量为15.6%）；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

KDN 型定氮仪（HYP8.14.20孔消化装置、2C型蒸馏装置），上海钎检仪器有限公司；JY－15 A 750克多功能粉碎机，永康市江业制造有限公司；UV－2100型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；p HS－25型数显p H计，上海精密科学仪器有限公司；JDG－0.2真空冻干试验机，兰州科近真空冻干技术有限公司；SHY－2 A水浴恒温振荡器，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

燕麦→粉碎、脱脂→脱脂燕麦全粉→碱液浸提→等电点沉淀→水洗至中性→真空冷冻干燥→燕麦蛋白。

1.3.2 方法

分别对p H值、料液比、提取温度、提取时间进行单因素试验，以蛋白质的提取率为指标，确定燕麦蛋白的提取条件，重复3次。在单因素试验基础上用Box－Behnken试验设计对p H、料液比、提取温度、提取时间，4个因素进行优化，确定碱提酸沉法制备燕麦蛋白的最佳工艺条件。

1.3.3 燕麦蛋白等电点的确定

在得到的最佳提取条件下提取燕麦蛋白，取8等份蛋白提取上清液，分别用1 mol·L－1HCl缓慢调其 p H 至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，静置6 h，4000 r·min－1离心15 min，测定沉淀前后上清液中蛋白质含量，计算蛋白分离率。

1.3.4 测定与计算方法

固体中蛋白质含量测定：凯氏定氮法，参照GB5009.5－2010。

溶液中蛋白质含量测定：Bradford法［12］，其标准曲线为y＝6.4343x－0.0079，R2＝0.9978。

2 结果与分析

2.1 碱提酸沉法提取燕麦蛋白单因素试验结果

2.1.1 p H值对蛋白质提取率的影响

由图1可见，随p H的升高，燕麦蛋白的提取率呈上升趋势。其中，p H在8～10内，随p H的升高燕麦蛋白的提取率迅速上升，在p H 10～12内，燕麦蛋白的提取率上升缓慢。研究发现，当p H超过11时，蛋白提取液颜色加深，呈棕褐色，有异味，且溶液变得十分粘稠，不利于进一步的分离。因此，选择p H 10为试验条件下的最佳p H，此时蛋白提取率达59.35%。

图1 p H值对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of p Hon extraction rate of oat granules

2.1.2 液料比对蛋白质提取率的影响

由图2可见，在液料比为8～16内，随液料比的升高，燕麦蛋白的提取率迅速上升，液料比为16时，燕麦蛋白的提取率最高，达60.36%；当液料比超过16时，蛋白的提取率变化不大。

图2 液料比值对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of liquid－to－solid ratio on extraction rate of oat granules

2.1.3 浸提温度对蛋白质提取率的影响

由图3可见，在温度20～40℃内，随温度的升高，燕麦蛋白的提取率上升较快；在40～50℃时，燕麦蛋白的提取率上升最快；当温度为50℃时，燕麦蛋白的提取率达59.99%，为最大值；超过50℃后，燕麦蛋白的提取率迅速下降。

图3 浸提温度值对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of oat granules

2.1.4 浸提时间对蛋白质提取率的影响

由图4可见，在时间为30～90 min内，随时间的延长，燕麦蛋白的提取率呈上升趋势，在90 min时，燕麦蛋白的提取率最大，为63.31%；超过90 min后，燕麦蛋白的提取率变化不大。

图4 浸提时间值对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of time on extraction rate of oat granules

2.1.5 Box－Behnken试验设计优化碱提酸沉法提取燕麦蛋白工艺

2.1.5.1 Box－Behnken试验因素的确定

根据单因素试验结果，采用Box－Benhnken试验设计，对影响燕麦蛋白提取率的4个因素（p H、液料比、温度和时间）进行全因素响应面分析，因素水平表如表1所示。

表1 响应面试验设计因素水平编码表Table 1 Factor levels and their coding

2.1.5.2 响应面试验及方差分析

Box－Behnken试验设计与结果如表2所示。为了更准确估计试验误差，对中心点p H 10、液料比16、浸提温度50℃、浸提时间90 min重复5次，得中心点条件下的平均蛋白提取率达63.20%。进一步用 Design－Expert.V8.0.6 进 行 响 应 面分析，得到回归方程：提取率 Y＝2.33 A－0.96B＋2.16C＋1.35D＋4.74 A＊B－1.68 A＊C＋0.88 A＊D－1.25B＊C－0.16B＊D＋0.68C＊D－5.02 A2－9.99B2－5.54C2－4.66D2＋63.20。

表2 Box－Behnken试验设计与结果Table 2 Result of Box－Behnken design

续表2

对模型进行矢拟性检验和方差分析，结果见表3。结果表明，此二次多项式模型的一次项和交互项极显著，平方项在显著范围内，而立方项不显著。该模型的失拟性不显著，模型极显著，说明该模型是合理可行的，能对各因素变化对燕麦蛋白提取率的影响有良好的预测作用。

表3 模型的矢拟性检验Table 3 Lack of fit test

进一步对二次多项式模型及各系数进行方差分析，结果见表4。由表4可见，p H、温度对燕麦蛋白提取率的影响极显著，时间对燕麦蛋白提取率的影响显著；交互作用中p H和液料比的交互作用极显著，其他因素间的交互作用均不显著；4个因素的二次项对燕麦蛋白提取率的影响极显著。

2.1.5.3 响应曲面分析

响应面图能直观地反映各因素对蛋白提取率的影响。从图5可见，燕麦蛋白提取率随p H和液料比的变化先增大后减小，且坡度较大，等高线密集，并出现极大值，表明两者的交互作用显著；其他因素间的响应面平缓，交互作用不显著，这与方差分析的结果一致。为进一步求得各因素的最优条件，以提取率最大为目标，对各因素在试验范围内进行最优化处理，得到最佳提取工艺为：p H 10.11、液料比15.96、温度50.87℃、时间93.56 min，此时提取率达63.76%。验证试验得该条件下燕麦蛋白的提取率达64.23%，纯度达86.4%。

表4 二次多项式模型的方差分析表Table 4 Analysis of variance for Response Surface Quadratic Model

图5 p H与液料比对蛋白提取率影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface plot and contour map for extraction rate of OPI under different p Hand liquid－solid ratio

2.1.6 燕麦蛋白等电点的确定

由图6可见，碱提酸沉法提取的燕麦蛋白的等电点为4.2，分离率达94.65%。p H 在4.0～4.5内，燕麦蛋白的分离率均达93.4%以上，分离效果较好。

图6 燕麦蛋白等电点的确定Fig.6 Determination on pI of oat protein

3 结论与讨论

碱提酸沉法制备燕麦蛋白的最佳工艺为：p H 10.11、液料比15.96、温度50.87℃、时间93.56 min，此时，提取率达64.23%，纯度达86.4%，得到的燕麦蛋白的等电点为4.2，分离率达到94.65%。

碱提酸沉法制备燕麦蛋白的p H不能超过11，否则会导致蛋白提取液颜色加深，产生异味，且溶液变得十分粘稠，不利于进一步的分离；为提高燕麦蛋白的提取率，同时减少燕麦蛋白的变性，提取温度控制在50℃左右为宜；当液料比超过16，或浸提时间超过90 min后，增加液料比或延长浸提时间对蛋白提取率的影响不大。

用此方法制备的燕麦蛋白粉颜色稍有褐变，可能是由于提取过程中蛋白质与还原糖发生了美拉德反应，或燕麦中的酚类物质氧化所致，其褐变机理及脱色方法还需进一步研究。

［1］Moha med A，Biresaw G，Xu Jingyuan，etal.Oats pr otein isolate：ther mal，r heological，surface and f unctional pr operties［J］.Food Research Inter national，2009，42（1）：107－114.

［2］周素梅，申瑞玲.燕麦的营养及其加工利用［M］.北京：化学工业出版社，2009：68－97.

［3］Welch R W.The Oat Cr op：Production and Utilization［M］.London：Chap man ＆ Hall Ltd.，1995：438－456.

［4］管骁.燕麦麸蛋白及ACE抑制肽制备工艺与功能特性研究［D］.无锡：江南大学，2007.

［5］Webster F H，Wood P J.Oats：Chemistry and Technology［M］.St Paul：American Association of Cereal Chemists Inc，2011：192－195.

［6］Mir moghtadaie L，Kadivar M，Shahedi M.Effects of succinylation and deamidation on f unctional properties of oat protein isolate［J］.Food Che mistry，2009，114（1）：127－131.

［7］江志炜，沈蓓英，潘秋琴.蛋白质加工技术［M］.北京：化学工业出版社，2002：76－84.

［8］马晓凤，刘森.燕麦品质分析及产业化开发途径的思考［J］.农业工程学报，2005，21（z1）：242－244.

［9］路长喜，周素梅，王岸娜.燕麦的营养与加工［J］.粮油加工，2008（1）：89－91.

［10］马涛，肖志刚.谷物加工工艺学［M］.北京：科学出版社，2009：390.

［11］陈宁.氨基酸工艺学［M］.北京：中国轻工业出版社，2007：366.

［12］谢笔钧，何慧.食品分析［M］.北京：科学出版社，2009：180－181.