三氧化二砷与顺铂联合诱导人卵巢癌HO8910细胞凋亡的初步研究

高洪泉 张爱清 田忠富

·论著·

三氧化二砷与顺铂联合诱导人卵巢癌HO8910细胞凋亡的初步研究

高洪泉 张爱清 田忠富

目的探讨三氧化二砷与顺铂联合对体外培养卵巢癌细胞株HO8910细胞增殖、细胞周期调控及细胞凋亡影响。方法用三氧化二砷与顺铂联合处理HO8910 细胞，采用MTT法检测药物对细胞的抑制作用，倒置显微镜观察细胞形态学改变；琼脂糖凝胶电泳观察DNA降解，以及应用流式细胞仪观察细胞凋亡过程中细胞周期的变化。结果在三氧化二砷与顺铂联合作用下，HO8910 细胞呈凋亡改变，DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型的凋亡特征。细胞凋亡的同时，细胞周期发生特定的改变。结论三氧化二砷与顺铂联合能抑制卵巢癌细胞增殖，能诱导卵巢癌细胞凋亡。

三氧化二砷(As2O3)；顺铂(DDP)； 细胞凋亡；卵巢癌细胞株

卵巢癌是是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤。众多研究表明肿瘤的发生发展不仅与细胞分化异常增殖过度有关，而且与细胞凋亡有关[1]。随着人们对细胞凋亡机制的深入研究，发现许多化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌效应的。因此探索药物诱导肿瘤细胞凋亡，将成为肿瘤治疗的新方向。本文探讨三氧化二砷与顺铂联合对体外培养卵巢癌细胞株HO8910细胞凋亡的作用[2]。

1 材料和方法

1.1材料及仪器 人卵巢癌细胞系HO8910购自中国科学院上海细胞生物研究所。三氧化二砷购自哈医大第一附属医院，顺铂购于锦州制药一厂。RPMI-1640培养基为美国Promega公司生产。使用前加小牛血清至10%，青霉素，链霉素至100 U/ml。流式细胞仪(FCM)为美国Coulter公司生产。碘化丙啶(PI)为美国Sigma公司生产。酶联免疫检测仪为美国Bio-TEK(型号EL-312E)产品。主要试剂为： EDTA[150 mmol NaCl加25 mmol 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)]；TBE缓冲液(89 mmol Tris 加 80 mmol硼酸，再加2.5 mmol EDTA)；1.5%琼脂糖凝胶(TBE缓冲液 100 ml加入 2g 琼脂糖加热融化)及10%十二烷基硫酸钠(SDS)(10 g SDS加水至100 ml)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 人卵巢癌细胞HO8910培养于含有10%小牛血清，100U/ml青霉素、链霉素RPMI 1640培养基中，在37℃、5%CO2培养箱内常规传代培养。

1.2.2MTT试验 药物组为DDP浓度为4 μmol/L，As2O3浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L共4组，用培养液稀释，卵巢癌细胞以103/ml接种于4块进口96孔培养板，每孔加200 μL培养液，每天用一块。每组设4个复孔，接种后24 h更换培养液。实验组加入各浓度药物培养液，对照不加药，空白对照不加培养液，加药后分别于24、48、72、96 h加入20 μlMTT，继续放入培养箱孵育4 h后吸出培养液，加入150 μl DMSO震荡溶解10 min，空白对照调零，酶联仪检测，波长490 nm，测定各孔的吸光值。计算抑制率，抑制率=[(阴性对照组OD值-实验组OD值)/阴性对照组OD值] ×100%。

1.2.3形态学观察 倒置显微镜下观察培养瓶内加药组和未加药组细胞形态变化情况。

1.2.4DNA Ladder测定 常规消化收集细胞，PBS洗一遍，按试剂盒步骤裂解细胞，RNase作用，蛋白沉淀，提取DNA，液氮中冻5 min，70%酒精洗DNA，真空抽干，溶于TE缓冲液中，常规1.5%琼脂糖电泳，电压60 v，电泳2 h，观察，照相。

1.2.5流式细胞术测定 取指数生长期细胞，采用PI检测法，药物作用48 h后，常规消化收集细胞，1000 r/min离心5 min，PBS洗两遍，重悬细胞于PBS中调整细胞浓度为106/ml，加RNase及PI，避光4℃染色30 min，上机检测。激发波长488 nm，检测3×104个细胞，用ModiFit软件分析

2 结果

2.1MTT试验结果 各浓度组药物对HO-8910卵巢癌细胞株均有明显的抑制增殖作用，同阴性对照组比较有统计学意义(P<0.05)，具有量效和时效关系，抑制率同作用时间呈直线相关(P<0.01)。培养基DDP浓度为4 μmol/L，As2O3浓度分别为1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L。其中2 μmol/L组在12、24、36、48、60小时抑制率分别为10.3%、22.6%、34.7%、47.5%、51.9%，8 μmol/L组在12、24、36、48、60 h抑制率分别为16.3%、37.5%、53.2%、82.3%，其中以8μmol/L作用60小时为最高(82.3%)(图1)。

图1 不同浓度药物作用下卵巢癌细胞抑制率变化

2.2形态学观察 倒置显微镜下每日观察对照组和各实验组细胞形态变化，发现随药物浓度和时间增加，低浓度三氧化二砷与顺铂联合和高浓度三氧化二砷与顺铂联合对卵巢癌细胞作用不同，主要表现在：⑴对卵巢癌细胞贴壁能力和集落性影响不同，2 μmol/L三氧化二砷与顺铂联合作用72 h后，细胞贴壁能力稍下降，极少细胞脱落，细胞生长呈集落性；8 μmol/L三氧化二砷与顺铂联合作用24 h即可见细胞贴壁能力明显下降，许多细胞脱落成漂浮生长状态，随作用时间延长， 脱落细胞逐渐增多，至60 h约有70%～80%的细胞呈悬浮生长，48 h时可见细胞集落生长特性明显降低，细胞开始呈单个生长状态，60h90%以上细胞呈单个生长状态。⑵细胞大小和形状变化：2 μmol/L三氧化二砷与顺铂联合作用72 h后，细胞稍变小，大多数细胞应呈梭形，部分细胞变圆，8 μmol/L三氧化二砷与顺铂联合作用24 h时可见大多数细胞变圆变小，随时间延长改变明显，72小时所有细胞RNase大小和形状同未加药的卵巢癌细胞完全不同(图2)。

图2A 正常卵巢癌细胞(10 ×10倍)

图2B 2 μmol/L三氧化二砷与4 μmol/L顺铂联合作用作用48 h卵巢癌细胞(10 ×10倍)

图2C 8 μmol/L三氧化二砷与4 μmol/L顺铂联合作用作用24 h卵巢癌细胞(10 ×10倍)

图2D 8 μmol/L三氧化二砷与4 μmol/L顺铂联合作用作用48 h卵巢癌细胞(10 ×10倍)

2.3DNA Ladder测定 2 μmol/L三氧化二砷与4 μmol/L顺铂联合作用作用48 h未见DNA Ladder出现，8 μmol/L三氧化二砷与4 μmol/L顺铂联合作用作用48 h时可见 DNA Ladder出现(图3)。

图3 DNA琼脂糖凝胶电泳结果

图3A:DNA Marker 图3B:2 μmol/L三氧化二砷与4 μmol/L顺铂联合作用作用48 h卵巢癌细胞 图3C:8 μmol/L三氧化二砷与4 μmol/L顺铂联合作用作用24 h卵巢癌细胞 图3D:8 μmol/L三氧化二砷与4 μmol/L顺铂联合作用作用48 h卵巢癌细胞

2.4流式细胞测定结果 经浓度为2、8 μmol/L三氧化二砷与顺铂联合分别作用48 h，可见亚G1峰出现，而对照组未见亚G1峰；药物组S+ G2～M期细胞所占比例较对照组明显增高，且随浓度增高而增高；低浓度和高浓度及对照组在凋亡率、细胞周期上的差别均有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图4A 图4A 正常卵巢癌细胞

3 讨论

As2O3、DDP对卵巢癌细胞均有诱导凋亡作用[3]。但单用时都需较高浓度才能达到理想效果。而DDP在治疗剂量内仍对人体有严重的肾毒性和骨髓抑制等不良反应。因此选择最低有效剂量的DDP应用于临床,对降低其毒副作用具有非常重要的意义。本实验发现As2O3、DDP联合作用时癌细胞的凋亡率明显高于单药组,表明两者有协同作用。特别是当As2O3浓度为8 μmol/L、DDP浓度为4 μmol/L时,癌细胞几乎全部死亡,大大高于相应单药组[4]。

肿瘤的发生和发展不仅同肿瘤细胞的增殖和分化异常有关，而且同细胞凋亡基因的变化有关。因此，诱导肿瘤细胞凋亡成为近年来肿瘤治疗方面的重点。细胞凋亡时的特点主要为形态和生化方面的改变，细胞体积变小，染色体凝聚成新月状，出现凋亡小体等特点；同时染色体由于内源性核酸内切酶作用产生180～200 bp的梯状片断。本组研究中不同浓度三氧化二砷与顺铂联合均可抑制卵巢癌细胞增殖，且有时效和量效关系，抑制率以8 μmol/L、DDP浓度为4 μmol/L为最高。倒置显微镜下有细胞凋亡的早期形态改变，但在低浓度时未观察到出现，DNA凝胶电泳表现出典型的“梯形”条带，流式细胞仪检测有细胞凋亡峰出现[5]。

通过以上观察结果，三氧化二砷与顺铂联合可诱导卵巢癌细胞株凋亡的作用是肯定的，但与浓度有关。低浓度抑制细胞增殖并不是通过细胞凋亡实现，其机制有待于探讨。进一步分析三氧化二砷与顺铂联合对卵巢癌细胞株周期的影响发现，其可阻滞细胞于S+ G2～M期，且在8 μmol/L、DDP浓度为4 μmol/L后随浓度增加抑制率并不增加，表明三氧化二砷与顺铂联合作用的细胞周期动力学机制可能为周期特异性药物，提示在应用时合用对S及 G2～M期敏感的药物可能有助于提高疗效[6]。

综上所述，三氧化二砷与顺铂联合可以诱导卵巢癌细胞株HO8910的凋亡，但存在浓度差异，在低浓度时抑制细胞增殖但没有启动凋亡，但在高浓度时抑制细胞凋亡为主；并使细胞周期阻滞于S+ G2～M期，这为进一步动物实验及其进一步的临床应用提供了实验依据[7]。

[1] 高洪泉,王英,郑海兴.苦参素诱导卵巢癌HO8910细胞凋亡.中医药学报，2004,32(6)：10-12.

[2] 李江涛，区庆嘉，魏箐.三氧化二砷诱导肝癌细胞凋亡的初步研究.癌症，2000,19(12):1087-1091.

[3] 刘勤，陈葳，李旭,等.顺铂诱导人卵巢癌AO 10/17细胞凋亡的实验研究.中华妇产科杂志，1998,(7)：35-37.

[4] 陈耀华，尹时生，田喜顺,等.复方苦参对恶性肿瘤T细胞亚群的影响.肿瘤研究与临床,1999,11(3)：191-192.

[5] 程国钧，李亚里，田方,等.不同方式诱导人卵巢癌顺铂耐药细胞株的比较.中华肿瘤杂志，2001,23(4)：305-308.

[6] Sood AK, Buller RE. Drug resistance in ovarian cancer: from the laboratory to the clinic. Obstet Gynecol, 1998,92:312-319.

[7] Coukos G, Rubin SC. Chemotherapy resistance in ovarian cancer: new molecular perspectives. Obstet Gynecol, 1998,91:783-792.

StudiesonArsenictrioxideandCisplatininducesapoptosisinOvarianCancercelllinesHO8910

GAOHong-quan，ZHANGAi-qing，TIANZhong-fu.
XiamenMedicalCollage157011，China

ObjectiveThe current study was designed to investigate whether Arsenic trioxide and Cisplatin can induces apoptosis in Ovarian Cancer cell.MethodsCell proliferation was assessed by MTT assays.Morphological changes of apoptosis were observed with invert microscope . DNA ladder and cell cycle were examined by DNA agarose gel eletronphores and PI fluorescence flow cytometry(FCM).ResultsUnder the influence of Arsenic trioxide and Cisplatin, HO8910 cell exhibited changes of apoptosis both in morphology and in the characteristics of electrophoresis.Meanwhile the cell cycle also showed special change.ConclusionArsenic trioxide and Cisplatin can inhibit cell proliferation, Arsenic trioxide and Cisplatin can induces apoptosis in Ovarian Cancer cell.

Arsenic trioxide； Cisplatin； apoptosis； Ovarian Cancer cell line

福建省教育厅基金资助项目(项目编号：2011)；厦门医学高等专科学校基金项目(项目编号：2009)

361008 厦门医学高等专科学校