异钩藤碱通过下调CaN、ERK2和上调MKP-1的表达抑制大鼠心肌细胞肥大

徐 洋，李 强，侯化化，张婧怡，张 锋，孙安盛

(遵义医学院药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099)

异钩藤碱通过下调CaN、ERK2和上调MKP-1的表达抑制大鼠心肌细胞肥大

徐 洋，李 强，侯化化，张婧怡，张 锋，孙安盛

(遵义医学院药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099)

目的研究异钩藤碱抑制大鼠心肌细胞肥大的作用并探讨其可能的作用机制。方法采用乳SD大鼠原代心肌细胞培养法，建立心肌细胞肥大模型；HE染色观察细胞形态学变化，采用图像分析系统测量心肌细胞的表面积、BCA法测定细胞蛋白质含量，确定药物抑制心肌细胞肥大的作用；实时荧光定量PCR检测细胞中CaN及ERK2 mRNA的表达、Western blotting检测细胞中MKP-1蛋白的表达,探讨药物作用的可能机制。结果异钩藤碱1 μmol / L、10 μmol / L明显抑制AngⅡ诱导心肌细胞表面积和蛋白含量的增加，改善心肌细胞形态学；明显抑制AngⅡ 所致CaN、ERK2 mRNA表达的增加，而各浓度组则显著升高MKP-1蛋白的表达。结论异钩藤碱具有抑制大鼠心肌细胞肥大的作用，其机制可能与抑制AngⅡ所致CaN、ERK2 mRNA表达和升高MKP-1蛋白的表达有关。

异钩藤碱;心肌细胞;肥大;血管紧张素Ⅱ;钙调神经磷酸酶;细胞外信号调节激酶2;丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1

心肌肥大是在多种病理因素刺激下发生的以心肌细胞体积增大、细胞间质组织增生，而无细胞分裂的病征。许多心血管疾病，如冠状动脉粥样硬化、原发性高血压、心肌梗塞等最终都发展为心肌肥大。目前心肌肥大已被视为心血管疾病致死的独立危险因素[1]，对其发病机制和防治的研究始终是心血管疾病领域的研究热点。异钩藤碱(isorhynchophylline，Iso)是常用传统中药钩藤〔Uncaria rhynchophylla(Miq．)Jackson〕所含主要生物碱，已报道Iso具有抑制血管平滑肌细胞增殖[2]、抗血管成纤维细胞增殖及胶原合成[3-4]、舒张血管[5]、抗炎[6]和具有神经保护等作用[7]，临床主要用于心血管和中枢神经系统疾病的治疗[8-9]。抗高血压药物若兼有抑制心肌肥厚效应，能明显增加其临床应用价值。实验采用体外培养的新生乳大鼠心肌细胞，研究Iso对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)所致心肌细胞肥大的作用，并对Iso抑制心肌细胞肥大的细胞内信号传导机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 主要药物与试剂 异钩藤碱(广西中药研究所，纯度≥96%)；AngⅡ(美国Sigma公司)；DMEM培养基、胎牛血清(FBS，上海玉博生物科技有限公司)；BCA蛋白测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)、细胞外信号调节激酶2(extracellularsignal-regulated kinase 2，ERK2)、丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)引物(大连宝生物公司)；荧光定量PCR混和液(英国ABI公司)。

1.2 仪器 CO2孵箱(美国SHELL公司)，Leica Qwin V3图像分析系统(德国Leica)，实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)，TU1810紫外可见分光光度计(北京普析仪器有限责任公司)。

1.3 动物 SD乳大鼠种鼠，清洁级，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，动物许可证:CXK(军)2007-017。

1.4 方法

1.4.1 原代乳大鼠心肌细胞培养及鉴定 无菌条件下，取出生1～3 d乳鼠的心室肌组织，置入预冷的D-Hank’s液中，将心室剪碎成1～3 mm3的小组织块，用0.125%胰蛋白酶消化，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中贴壁1.5 h后，将未贴壁的心肌细胞吸到含20%胎牛血清的DMEM培养液中，计数，最后按实验不同要求接种培养。乳大鼠心肌细胞通过抗α-肌动蛋白免疫组化鉴定，细胞纯度≥95%用于实验。

1.4.2 实验分组及给药 实验分为正常对照组,不含血清的DMEM培养基,模型组(AngⅡ 1 μmol/L)；Iso低(0.1 μmol/L)、中(1 μmol/L)、高(10 μmol/L)浓度组。Iso各浓度组加入试药30 min后，加入AngⅡ1 μmol/L，作用48 h用于各指标的检测。

1.4.3 心肌细胞表面积的测定 将心肌细胞5×108/L接种于6孔板中，给予试药48 h后进行HE染色，采用Leica Qwin V3图像分析系统测量心肌细胞的表面积。随机选取5个视野，每视野随机测定10个细胞，每组重复3次。

1.4.4 心肌细胞蛋白质含量的测定 心肌细胞5×108/L接种于24孔板中，加入试药48 h后吸弃培养基，PBS洗3次。加入RIPA裂解缓冲液后收集心肌细胞，冰浴下超声破碎细胞，4 ℃，12 000×g离心0.5 h，吸取上清液按试剂盒规定操作，计算每孔心肌细胞蛋白质的含量。

1.4.5 RT-PCR 检测心肌细胞中CaN及ERK2 mRNA的表达 心肌细胞3×108/L密度接种于25 ml培养瓶内，加入试药培养48 h后通过Trizol法提取心肌细胞总RNA，紫外分光光度计波长260 nm和280 nm检测吸光度(A)，A260 nm/A280 nm值为1.8～2.0。将其逆转录为cDNA，进行PCR扩增。β肌动蛋白为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算CaN和ERK2基因的相对表达水平。引物序列：β肌动蛋白150 bp，上游5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；CaN1 22 bp，上游5'-CTGAGATGCTGGTAAACGTCCTGA-3'，下游5'-TGCTCGGATCTTGTTCCTGATG-3'；ERK2 101 bp，上游5'-GGCACCAACCATTGAGCAGA-3'，下游5'-GATCATTGCTGAGGTGCTGTGTC-3'。

2 结果

2.1 Iso对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的抑制作用 细胞形态学可见，AngⅡ组比较正常对照组，心肌细胞明显增大，细胞肿胀，分界不清。Iso合用AngⅡ各组可明显缩小细胞，减轻肿胀，心肌细胞形态学的改善呈剂量依赖性(见图1)。图像分析测量表明,AngⅡ组使心肌细胞表面积增加了181.7%(P<0.01)，蛋白质含量增加32.0%(P<0.01,见图2)。与AngⅡ组比较，Iso中和高浓度明显抑制心肌细胞表面积和蛋白含量增加，其抑制率分别为23.4%、50.3%(P<0.01)和17.7%(P<0.05)、21.2%(P<0.01)。

注：A:Control;B:Ang ll 1×10-6;C:Iso 1×10-7D:Iso 1×10-6；E：Iso 1×10-5。 图1 Iso对AngⅡ诱导的心肌细胞的影响(HE×400)

注：A:假手术组;B:模型组(AngⅡ1 μmol/L);C:低剂量组(AngⅡ+Iso0.1 μmol/L);D:中剂量组(AngⅡ+Iso1 μmol/L);E:高剂量组(AngⅡ+Iso10 图2 Iso对AngⅡ诱导的肥大心肌细胞的表面积、蛋白质含量的影响

2.2 Iso对AngⅡ诱导的肥大心肌细胞中CaN和ERK2 mRNA表达的影响 Real time RT-PCR结果显示，与对照组比较，AngⅡ上调CaN和ERK2 mRNA的表达，分别增加了1.66倍和1.78倍(P<0.01)。Iso中、高浓度显著抑制AngⅡ所致CaN、ERK2 mRNA表达的增加，抑制率分别为41.1%、58.0%(P<0.01)和31.8%、45.7%(P<0.01,见表1)。

组 别C(μmol/L)CaNmRNAERK2mRNAControl-93．00±9．4987．55±15．39Model(AngⅡ)1247．24±33．69∗243．39±33．24∗AngⅡ+Iso0．1203．41±38．35202．83±34．52AngⅡ+Iso1145．73±25．01#166．01±24．38#AngⅡ+Iso10103．81±6．58#132．17±30．66#

注：*P<0.01vscontrol group;#P<0.01vsmodel group。

2.3 Iso对AngⅡ诱导的肥大心肌细胞中MKP-1蛋白表达的影响 结果表明，与正常对照组比较，AngⅡ组降低MKP-1的蛋白表达，为对照组的48.5%(P<0.01)。与AngⅡ组比较，Iso低、中、高浓度组明显提高MKP-1蛋白的表达，分别增加36%、66%和78%(见图3)。

注：A:假手术组;B:模型组(AngⅡ1 μmol/L);C:低剂量组(AngⅡ+Iso0.1 μmol/L);D:中剂量组(AngⅡ+Iso1 μmol/L);E:高剂量组(AngⅡ 图3 Iso对AngⅡ诱导的肥大心肌细胞中MKP-1蛋白表达的影响

3 讨论

体外培养的心肌细胞在保持其体内原有结构和功能的同时，可排除神经、体液等因素的干扰，并且采用不同的生长因子和细胞因子刺激，可引起与在体心肌肥大类似的病理改变，故目前乳大鼠心肌细胞原代培养技术已广泛应用于心血管疾病及药物的研究。

在心肌肥大众多的参与因子中，AngⅡ是重要的体液因子，AngⅡ与AT-1受体结合产生刺激，引起心肌细胞生长及细胞间质的堆积，导致心肌肥大[10]。目前AngⅡ作为经典的心肌细胞肥大的诱导剂，广泛用于实验性心肌肥大的研究。我们利用AngⅡ为诱导剂，观察到AngⅡ明显增加心肌细胞体积、细胞肿胀且分界不清等病理变化，同时测得心肌细胞表面积和细胞内蛋白质含量明显增加，表明模型制作成功。

心肌肥大的病理过程十分复杂，目前虽然对其尚不能完全明了，但在细胞水平上包括3个主要环节，导致心肌肥大的细胞外刺激、细胞内信号转导和细胞核内基因转录的活化，最终诱发细胞发生肥大表型变化[11]。MAPK通路是AngⅡ诱导心肌细胞肥大反应的重要细胞内信号传导通路，细胞外信号调节激酶2(ERK2)是重要的MAPK家族成员，MAPK/ERK信号通路受到蛋白激酶的磷酸化及蛋白磷酸酶的去磷酸化调节,磷酸化使其活化而去磷酸化使其失活。MAPK被其上游MAPK激酶ERK2磷酸化才具有活性，促进心肌细胞肥大。丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶(MAPK Phosphatase,MKP)具有多种亚型，近来报道除MKP-1外，MKP-2和MKP-3均能作用于ERK，使其去磷酸化而失活，从而阻断MAPK/ERK信号通路[12-13]。我们的实验选用经典的MKP-1，与模型组ERK2 mRNA表达显著升高比较，Iso中和高浓度组明显抑制AngⅡ诱导ERK2 mRNA的高表达，同时提高MKP-1蛋白表达水平，从而增加对ERK2的灭活，抑制心肌肥大的发生。新近研究表明CaN介导的信号通路参与心肌肥大的调节[14],CaN是由结合CaM的催化亚基(CnA)和结合Ca2+的调节亚基(CnB)组成的二聚体。Ca2+/CaM的结合诱发CnA构象改变,暴露其磷酸酶活性位点而活化CaN，后者使活化T细胞核因子3(nuclear factor of activated T cells3，NFAT3)去磷酸化进而转位入细胞核,最终导致心肌肥大。AngⅡ显著增加CaN mRNA表达，Iso中、高浓度组明显抑制AngⅡ诱导ERK1 mRNA的高表达，提示Iso抑制心肌细胞肥大的作用也与其阻滞CaN介导的信号传导通路有关。

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[收稿2012-03-27;修回2013-04-14]

(编辑：谭秀荣)

Isorhynchophyllineinhibitsthecardiomyocytehypertrophyinneonateratsbythedown-regulationofCaNandERK2mRNAexpressionsandup-regulationofMKP-1proteinexpression

Xuyang,Liqiang,Houhuahua,Zhangjingyi,Zhangfeng,Sunansheng

(Department of Pharmacology and The Key Laboratory of Basic Pharmacology of Guizhou Province, Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China)

ObjectiveTo investigate the effects of isorhynchophylline (Iso) on rat cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ(AngⅡ) and further explore the possible mechanisms.MethodsPrimary cardiomyocytes from neonatal SD rats were cultured in vitro to establish the cardiomyocyte hypertrophy model. Cell morphological changes were analyzed by HE staining and the cardiomyocyte surface area was measured by Leica Qwin V3 imaging analytic system. Protein content was detected by BCA assay to investigate the inhibitiory effects of Iso. The expressions of extracellular signal-regulated kinase 2 ( ERK2 ) and calcineurin (CaN) mRNA in cardiomyocytes were measured by real-time RT-PCR and MAPK Phosphatase-1 (MKP-1) examined by western blotting assay for exploring the possible mechanisms.ResultsIso (1 and 10 μmol/L) significantly inhibited the increase of cardiomyocyte surface area and protein content and improved the cardiomyocyte morphological damage induced by AngⅡ. Simultaneously, Iso ( 0.1,1 and 10 μmol/L) decreased the elevated CaN and ERK2 mRNA expressions induced by AngⅡ and up-regulated the MKP-1 protein expression.ConclusionIso could significantly attenuate the cardiomyocyte hypertrophy and this effect appears to be related to increasing MKP-1 protein expression and decreasing CaN and ERK2 mRNA expressions.

Isorhynchophylline; myocytes; hypertrophy; angiotensinⅡ; calcineurin; extracellular signal-regulated kinase 2; MAPK Phosphatase-1

R 969

A

1000-2715(2013)03-0210-04

国家自然科学基金资助项目(NO:81160528); 贵州省中医药局资助项目(NO:黔中医药2009-79)。

孙安盛，男，教授，硕士生导师，研究方向：心血管药理学，E-mail: anshengsun@yahoo.com.cn。